Proteinase K, lyophilized

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A propos de la protéinase K
En biologie moléculaire, la protéinase K (EC 3.4.21.64, protéase K, endopeptidase K, protéinase alcaline de Tritirachium, protéinase à sérine de Tritirachium album, protéinase K de Tritirachium album) est une protéase à sérine à large spectre. L'enzyme a été découverte en 1974 dans des extraits du champignon Engyodontium album (anciennement Tritirachium album). La protéinase K digére les cheveux (kératine), d'où son nom de "protéinase K". Le site de clivage le plus fréquent est la liaison peptidique à côté du groupe carboxyle des acides aminés aliphatiques et aromatiques avec des groupes alpha-amino bloquants. La protéinase K est souvent utilisée en raison de sa grande spécificité. La protéinase K appartient à la famille des peptidases S8 (subtilisine). Le poids moléculaire de la protéinase K est de 28 900 daltons (28,9 kDa).

Activité de la protéinase K
Activée par le calcium, l'enzyme protéinase K digère les protéines de préférence pour les acides aminés hydrophobes (acides aminés aliphatiques, aromatiques et autres hydrophobes). Les ions calcium n'influencent pas l'activité de l'enzyme, mais contribuent à sa stabilité. Les protéines sont complètement digérées si le temps d'incubation est long et si la concentration de proteinase est élevée. Lorsque les ions calcium sont éliminés, la stabilité de l'enzyme est réduite, mais l'activité protéolytique est maintenue. La protéinase K possède deux sites de liaison pour le Ca2+, bien que proches du site actif, ne sont pas directement impliqués dans le mécanisme catalytique. L'activité résiduelle -sans Ca2+- est suffisante pour digérer les protéines normalement présentes lors des préparations d'acides nucléiques. De ce fait, la digestion de la protéinase K pour la purification des acides nucléiques est le plus souvent effectuée en présence d'EDTA (inhibition des enzymes dépendantes des ions métalliques comme les nucléases).

Stabilité de la protéinase K
La protéinase K est stable dans une large gamme de pH (4-12), le pH optimal d’activité enzymatique est de 8,0. L'augmentation de la température de réaction de 37 °C à 50-60 °C augmente fortement l'activité enzymatique, tout comme l'ajout de 0,5-1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS) ou de chlorure de guanidinium (3 M), de thiocyanate de guanidinium (1 M) et d'urée (4 M). Les conditions décrites ci-dessus augmentent l'activité de la protéinase K en rendant plus accessibles les sites de clivage de son substrat. Des températures supérieures à 65 °C, l'acide trichloracétique (TCA) ou les inhibiteurs de protéase à sérine AEBSF, PMSF ou DFP inhibent l'activité. La protéinase K n'est par contre pas inhibée par le chlorure de guanidinium, le thiocyanate de guanidinium, l'urée, le sarcosyl, le Triton X-100, le Tween 20, le SDS, le citrate, l'acide iodoacétique, l'EDTA ou d'autres inhibiteurs de sérine protéase tels que la Nα-tosyl-Lys chlorométhylcétone (TLCK) et la Nα-tosyl-Phe chlorométhylcétone (TPCK).

Applications de la protéinase K
La protéinase K est largement utilisée en biologie moléculaire pour digérer les protéines et éliminer les impuretés des préparations d'acides nucléiques. En ajoutant la protéinase K aux préparations d'acides nucléiques, les nucléases qui pourraient autrement dégrader l'ADN ou l'ARN pendant la purification sont rapidement inactivées. La protéinase K est bien adaptée à ces preparations d’extraction car l'enzyme est active en présence de produits chimiques dénaturants les protéines comme le SDS et l'urée, d'agents chélateurs comme l'EDTA, de réactifs à base de sulfure d'hydrogène et d'inhibiteurs de trypsine ou de chymotrypsine. La protéinase K est utilisée pour la destruction des protéines dans les lysats cellulaires (tissus, cellules de culture cellulaire) et pour la libération des acides nucléiques. La protéinase K inactive efficacement les DNases et les RNases. Quelques exemples d'applications : La protéinase K est très utile pour la purification d'ADN ou d'ARN naturels et non endommagés, car la plupart des DNases et RNases microbiennes ou mammaliennes sont rapidement inactivées par l'enzyme, en particulier en présence de 0,5-1% de SDS. L'activité de l'enzyme envers les protéines natives est stimulée par des dénaturants tels que le SDS. En revanche, lorsqu'elle est mesurée avec des substrats peptidiques, les dénaturants inhibent l'enzyme.

Inhibiteurs de la protéinase K
La protéinase K possède deux liaisons disulfure. Une activité protéolytique accrue en présence d'agents réducteurs (par exemple, le DTT 5 mM) est observée, ce qui indique que la réduction présumée de ses propres liaisons disulfure ne conduit pas à son inactivation. La protéinase K est inhibée par les inhibiteurs de protéase à sérine tels que le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), le fluorophosphate de diisopropyle (DFP) ou le fluorure de 4-(2-aminoéthyl)benzènesulfonyle (AEBSF). L'activité de la protéinase K n'est pas affectée par les réactifs modificateurs de sulfite tels que l'acide para-chloromercuribenzoïque (PCMB), la N-alpha-tosyl-L-lysyl chlorométhyl cétone (TLCK) ou la N-alpha-tosyl-l-phénylalanine chlorométhyl cétone (TPCK), bien qu'elle soit susceptible d'être inhibée lorsque ces réactifs sont utilisés conjointement avec des réactifs disulfures réducteurs qui exposent les thiols normalement indisponibles de la protéinase K.

FAQs

Quel est le numéro CAS de la protéinase K?

Le numéro CAS de la protéinase K est 39450-01-6.

CAS Protéinase K ?

Le numéro CAS de la protéinase K est 39450-01-6.

CAS 39450-01-6?

Le numéro CAS 39450-01-6 est attribué à la protéinase K.

Comment la protéinase K est-elle inactivée ?
L'inactivation de la protéinase K est peut-être l'une des questions les plus fréquentes que nous recevons. Et la réponse est très simple. La chaleur est une méthode couramment utilisée pour inactiver la protéinase K. Alors que l'activité de la protéinase K augmente avec la température et est optimisée à environ 65 ˚C, le chauffage à 95 ˚C pendant 10 minutes inactive la protéinase K. Cependant, il faut noter que le chauffage de la protéinase K n'inactive pas complètement l'enzyme. Une petite quantité d'activité subsiste toujours avec cette méthode. Les inhibiteurs de protéase tels que le PMSF et l'AEBSF (Pefabloc®) peuvent également être utilisés pour inactiver définitivement la protéinase K. Remarque: la température réelle d'inactivation est controversée et varie de 70 à 95 ˚C. Cependant, sur la base des commentaires du public et de recherches approfondies, nous avons décidé que la meilleure température d'inactivation est de 95 ˚C.

Quelle est la température optimale pour l'activation de la protéinase K?

Comme mentionné dans la question 1, l'activité de la protéinase K augmente avec la température (dans une certaine mesure). La température optimale pour l'activité se situe entre 50 et 65 ˚C. Les températures plus élevées favorisent le clivage des protéines et permettent à la protéinase K de les dégrader plus facilement. Mais l'optimisation de la protéinase K n'est peut-être pas la partie la plus importante de votre procédé. Parfois, des techniques spéciales nécessitent des températures adaptées pour obtenir les meilleurs résultats globaux. Par conséquent, vous devez également garder à l'esprit que, bien que la plage de température rapportée pour l'activité de la protéinase K soit large, l'enzyme est toujours active à des températures comprises entre ~20 et 65 ˚C, et que cette grande flexibilité de température peut être utile pour des méthodes très spécifiques que vous effectuez. À des températures supérieures à 65 ˚C, il y a un risque que la protéinase K devienne inactive.

Quelle est la relation exacte entre la protéinase K et le calcium?

La protéinase K se lie à deux ions Ca2+ qui contribuent à maintenir la stabilité de l'enzyme, notamment lorsqu'elle est exposée à des températures élevées. Le calcium protège également la protéinase K de l'autolyse. Le rapport calcium/chaleur contribue à maintenir la thermostabilité de la protéinase K, mais n'est pas nécessaire à l'activité protéolytique. Selon Richard Tullis et Harvey Rubin, cette relation devient encore plus intéressante lorsque la DNase I est impliquée. La protéinase K est connue pour inactiver les DNases et les RNases, mais lorsque la DNase I est en présence de Ca2+, elle est protégée par la protéinase K (concentration de 1 mg/mL). La RNase, par contre, est inactivée, que le Ca2+ soit présent ou non. Vos résultats suggèrent une méthode pour traiter la RNase contaminée sans DNaseI ou pour purifier l'ARN hautement polymérisé.

L'EDTA inactive-t-il la protéinase K?

Cette question semble également revenir fréquemment lorsqu'on parle de la protéinase K. Les agents chélateurs tels que l'EDTA ou l'EGTA n'ont pas d'effet direct sur l'activité enzymatique de la protéinase K. La raison pour laquelle on utilise l'EDTA avec la protéinase K pendant la purification de l'ADN ou de l'ARN est généralement d'éliminer le calcium (voir également la question n°3). Cependant, étant donné que le calcium est lié à la stabilité de la protéinase K, l'ajout d'EDTA peut affecter le calcium et donc réduire l'activité de la protéinase K dans une certaine mesure.

Que sont les activateurs de la protéinase K?

Les activateurs de la protéinase K sont le SDS (dodécylsulfate de sodium) et l'urée. En général, la protéinase K devient plus stable et plus active dans les tampons contenant ces activateurs.

Comment la protéinase K joue-t-elle un rôle dans la lyse cellulaire ?

Pour répondre à cette question, nous devons d'abord savoir ce qu'est la protéinase K. Il s'agit d'une protéase à large spectre capable de digérer un large éventail de protéines natives (voir ci-dessous pour plus de détails). Lors de la lyse cellulaire, en particulier lors de l'isolement et de la purification ultérieurs de l'ADN, la protéinase K peut faire partie des étapes de la lyse en digérant les protéines de surface. Plus tard dans le processus, lorsque vient le moment de remettre en suspension et de lyser les noyaux dans un tampon contenant de la protéinase K, la protéinase K contribue à la digestion des protéines qui, autrement, dégraderaient l'échantillon.

Why do many recipes for DNA extraction buffers require the use of proteinase K and RNase?

Cette question revient sans cesse car la suggestion semble être une contradiction. La protéinase K est connue pour digérer les RNases. Alors pourquoi mettre les deux ensemble dans un tampon de lyse? Tout d'abord, vous voulez ajouter de la RNase parce qu'elle dégraderait l'ARN contaminant pendant la purification de l'ADN. Et vous voulez utiliser la protéinase K parce qu'elle peut dégrader les protéines nuisibles, les DNases et les RNases. La réponse à cette question est une question de timing et d'optimisation. Certains chercheurs suggèrent d'ajouter d'abord la RNase et de lui laisser le temps d'agir. La protéinase K et le SDS peuvent ensuite être ajoutés pour dégrader les protéines indésirables. Certains protocoles nécessitent une incubation du SDS, de la protéinase K et de la RNase à 37˚C pendant un certain temps. L'activité de la protéinase K n'étant pas aussi optimisée à cette température, cela donne probablement à la RNase plus de temps pour agir. Les étapes suivantes du protocole suggèrent une seconde incubation à 55 ˚C pendant une période plus longue, ce qui serait une température optimale pour l'activité de la protéinase K et lui permettrait de digérer d'autres protéines indésirables.

Pour quelles applications la protéinase K est-elle utilisée?

La protéinase K est une protéase à sérine à large spectre qui appartient à la classe des protéases de type subtilisine (il existe deux types de protéases à sérine, de type chymotrypsine et de type subtilisine). En tant que protéase à large spectre, elle est principalement utilisée pour l'isolement des acides nucléiques: ADN génomique, ARN cytoplasmique, ADN et ARN à haute négativité, etc. Elle est idéale pour ces applications car la protéinase K est capable de dégrader les protéines et d'inactiver les DNases et RNases qui, autrement, dégraderaient un échantillon d'ADN ou d'ARN souhaité. Pour simplifier la liste, la protéinase K est utilisée pour : la digestion des protéines indésirables dans les applications de biologie moléculaire, l'élimination des endotoxines liées aux protéines cationiques telles que le lysozyme et la RNaseA, l'élimination des nucléases pour l'hybridation in situ, la recherche sur les prions liée aux EST (encéphalopathies spongiformes transmissibles), l'empreinte protéasique, la purification des mitochondries, la purification de l'ADN génomique, la purification de l'ARN cytoplasmique, la purification de l'ADN ou de l'ARN à haute négativité.

Comment la protéinase K doit-elle être stockée/quelle est la durée de conservation de la protéinase K?
Solution mère: normalement les solutions mères sont stables à -20˚C jusqu'à 1 an. Poudre lyophilisée: normalement, les poudres lyophilisées sont séchées à -20 ˚C jusqu'à 2 ans. Toutefois, les dispositions des certificats d'analyse des fabricants respectifs s'appliquent, qui peuvent différer de cette déclaration.

Dans quoi peut-on dissoudre la protéinase K / Comment dissoudre la protéinase K?

La protéinase K est très soluble dans l'eau et peut également être dissoute dans du Tris ou du PBS. Cependant, lorsqu'on travaille avec du PBS, cela peut être un peu difficile, peut-être à cause du pH (toujours dans la gamme optimale, mais à l'extrémité inférieure de cette gamme). Habituellement, l'ajout de poudre de protéinase K en petites quantités en l'agitant dans la solution aidera à la dissoudre dans le PBS.

Comment les nucléases sont-elles inactivées par la protéinase K?

La protéinase K est connue pour protéger les acides nucléiques de la dégradation des protéines. Cela se produit parce que la protéinase K est capable de digérer les protéines qui endommageraient normalement votre échantillon. Ce protocole explique plus en détail comment utiliser la protéinase K pour inactiver les nucléases pendant vos procédures d'extraction.

Existe-t-il une alternative à l'utilisation de la protéinase K dans les extractions d’ADN?

L'avantage d'utiliser la protéinase K dans l'extraction de l'ADN est qu'elle peut dégrader une variété de nucléases nuisibles. Elle est également excellente pour la digestion des protéines de surface des membranes cellulaires. Toutefois, si cette question vise spécifiquement à isoler l'ADN d'autres protéines, l'extraction au phénol-chloroforme est une autre option appropriée pour éliminer les protéines d'une solution. Toutefois, cette méthode est plus toxique.

Quel est le rapport entre la protéinase K et les maladies à prions ou les EST?

La protéinase K est impliquée dans la distinction entre la PrP C normale (protéine prion/résistante) et la PrPSC (isoforme pathogène). La PrPC et la PrPSC ont toutes deux le même poids moléculaire, mais la PrPSC est résistante à la protéinase K. Les échantillons susceptibles de contenir les deux sont traités à la protéinase K, qui élimine la PrPC et convertit la PrPSC en PrPRES, qui a un poids moléculaire plus faible et peut être détachée puis distinguée.

Quel est le poids moléculaire de la protéinase K?

Le poids moléculaire de la protéinase K est de 28,5 kDa.

Quelle est la valeur optimale du pH pour la protéinase K?

La protéinase K est active à un pH compris entre 7,5 et 12,0

Quelle est la séquence primaire de la protéinase K?

GAAQTNAPWGLARISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEASHPEFEGRAQMVKTYYSSRDGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGYSTIIAGMDFVASDKNNRNCPVVASLSLGGGYSVNSAAARLQSSGVMVAAGNNADARNYSPASIPSVCTVGASDRYRSSFSNYGSVLDIFGPGTSILSTWIGGSTRSISGTSMATPHVAGLAAYLMTLGKTTAASACRYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQA

Qu'est-ce que la protéinase K?

Nous avons décidé de laisser cette question à la fin, principalement parce que la réponse se trouve facilement sur notre site et qu'elle est évoquée sur cette page. Cependant, la question mérite son propre espace ici. La protéinase K est une protéase à sérine à large spectre appartenant à la famille des subtilisines. Elle est connue dans la recherche pour sa capacité à inactiver les RNases et les DNases qui endommageraient les échantillons d'acides nucléiques désirés pendant l'extraction. Elle doit son nom à sa capacité, découverte à l'origine, d'hydrolyser la kératine.

Pourquoi la protéinase K est-elle utilisée dans l'extraction de l’ADN?

La protéinase K est utilisée dans l'extraction de l'ADN pour digérer les nombreuses protéines contaminantes présentes. Elle dégrade également les nucléases qui peuvent être présentes lors de l'extraction d'ADN et protège les acides nucléiques de l'attaque des nucléases.

Quelles sont les applications de la protéinase K?

Applications des technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS) et des microréseaux : Purification de l'acide nucléique par inactivation des nucléases dans l'extraction de l'ADN et de l'ARN à partir de lysats de levures, de bactéries, de cellules de mammifères et de cellules végétales, amélioration de l'efficacité du clonage des produits de PCR, préparation des échantillons pour la quantification des niveaux d'adduits de l'ADN par spectrométrie de masse par accélérateur, inactivation des cocktails d'enzymes dans les essais de protection contre les ribonucléases, ajout de procédures d'extraction pour optimiser le rendement en ARN des tumeurs mammaires primaires pour les études de microréseaux. Applications en biologie moléculaire : détection des protéines de l'encéphalopathie spongiforme bovine qui présentent une résistance unique à la dégradation protéolytique. Digestion des tissus (dénaturation des protéines) comme préparation alternative des échantillons pour l'analyse quantitative par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem. Modification spécifique des protéines de surface cellulaire afin d'analyser les structures membranaires pour la localisation des protéines, génération de fragments de protéines pour la caractérisation d'études fonctionnelles.

Quelles sont les directives pour l'utilisation de la protéinase K?

Isolement de l'ADN de haut poids moléculaire: L'ADN chromosomique qui a été inclus dans des bouchons d'agarose peut être traité avec de la protéinase K pour inactiver les enzymes de restriction utilisées pour digérer l'ADN. L'enzyme est utilisée pour cette méthode à une concentration de 1 mg/mL dans un tampon contenant 0,5 M EDTA et 1% de N-lauroylsarcosine (v/v). Incuber pendant 24-48 heures à 37 °C. Isolement de l'ADN génomique et plasmidique: L'ADN génomique ou plasmidique peut être purifié à partir de cellules congelées dans l'azote liquide ou de cellules cultivées en utilisant la protéinase K. Incuber 50-100 mg de tissu ou 1x108 cellules dans 1 ml de tampon contenant 0,5% de SDS (p/v) avec de la protéinase K à une concentration de 1 mg/mL à 50 °C pendant 12-18 heures. Isolation de l’ARN: Pour l'isolement de l'ARN cytoplasmique, centrifuger le lysat cellulaire, retirer le surnageant et ajouter 200 ug/mL de protéinase K et 2 % (p/v) de SDS. Incuber pendant 30 minutes à 37 °C. L'ARN total peut être isolé en séparant le lysat avant le traitement enzymatique et est extrait à l'aide d'une aiguille fixée à une seringue. Inactivation des RNases, DNases et enzymes dans les réactions : la protéinase K est active dans une variété de tampons. L'enzyme doit être utilisée dans un rapport d'environ 1:50 (p/p, protéinase K: enzyme). Incuber à 37 °C pendant 30 minutes. Pourquoi la digestion se produit-elle à 50 °C? En augmentant la température à 50 °C, certaines protéines sont dépliées afin de pouvoir être dégradées plus facilement par la protéinase K. L'enzyme est stable et son activité augmente. L'enzyme est stable et son activité augmente considérablement lorsque des dénaturants tels que le SDS et l'urée sont ajoutés

Quel est le moyen le plus rapide et le plus efficace d'inactiver la protéinase K?

Comme pour la plupart des protéines, la manière la plus efficace d'inactiver l'enzyme est d'augmenter la température ou de modifier significativement le pH. La protéinase K est inactivée par la chaleur (par exemple, une incubation à 55°C). Comment pouvez-vous savoir si l'enzyme fonctionne? Pour déterminer si l'enzyme fonctionne, vous pouvez effectuer les 2 étapes suivantes: Déterminez combien de micromoles de p-nitroanilide sont produites par minute. Divisez ensuite par la quantité totale de protéines dans la solution. De cette façon, vous pouvez déterminer l'activité spécifique de l'enzyme = unités (une unité est égale à 1 mole de p-nitroanilide produite par minute), activité spécifique = unités d'activité de l'enzyme/mg de protéine totale.

Où la protéinase K est-elle clivée?

La protéinase K clive les liaisons peptidiques ainsi que le groupe carboxyle des acides aminés hydrophobes, aliphatiques et aromatiques N-substitués. Elle clive également les amides de peptides.

Quelle est la durée de vie de la protéinase K?

La protéinase K a une durée de conservation de 6 mois si elle est stockée dans un endroit sec à 4-8 °C, car elle est très stable. Un stockage à court terme à température ambiante n'affecte pas l'activité et la stabilité de la protéinase K. Toutefois, les conditions du fabricant figurant dans les certificats d'analyse s'appliquent.

Quel est le rôle de la protéinase K dans l'essai Covid-19?

La protéinase K joue un rôle important dans la préparation des échantillons pour le test PCR pour Covid-19. La protéinase K a pour fonction de digérer les protéines de l'échantillon, en particulier la nucléase, qui, sinon, favoriserait la dégradation de l'ADN et de l'ARN de l'échantillon et fausserait ainsi le résultat final du test.

Où trouve-t-on la protéinase dans la nature?

La protéinase a été découverte pour la première fois en 1974 dans des extraits du champignon Engyodontium album (anciennement Tritirachium album).

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