Formamid deionisiert (Reag. USP, ACS) zur Analyse, Molekularbiologie

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RNA oder DNA mit einer Kettenlänge >150 - 200 Basenpaare denaturiert komplett bei Raumtemperatur in 98% Formamid, nicht jedoch in 7 M Harnstoff. Auf diese Weise ist die Größe der DNA-/RNA -Einzelstränge genau bestimmbar, da unter diesen Bedingungen die Basenzusammensetzung und Sekundärstruktur ohne Bedeutung sind. Das Polyacrylamidgel muß 98% Formamid (deionisiert und wasserfrei) enthalten. Dabei wird Acrylamid und Bisacrylamid im Formamid gelöst (1-4). Entsprechend werden auch Formamid-haltige Ladepuffer (Ladepuffer VI Sequenziergele oder Ladepuffer VII denaturierende Agarose-Gele von PanReac AppliChem) verwendet.Auch bei der Sequenzierung von Nukleinsäuren kann Formamid nützlich sein. Bandenkompressionen durch anormales Wander der Nukleinsäurefragmente können auftreten, wenn das Sequenzierprodukt Sekundärstrukturen ausgebildet hat. Diese werden durch Zugabe von Formamid (bis zu einer Endkonzentration von 40 %) zusätzlich zum Harnstoff im Gel destabilisiert (Ref. 8, S. 7.6.9-7.6.10 Supplement 16).Die Stabilität von RNA ist in Formamid wesentlich höher als in DEPC-behandeltem Wasser. Die Langzeit-Lagerung von über einem Jahr kann bei -20°C erfolgen, statt -70°C bei Lagerung in DEPC-behandeltem Wasser.Neben der Gelelektrophorese findet deionisiertes Formamid auch in der Hybridisierung von Nukleinsäuren Anwendung. Formamid reduziert die Schmelztemperatur eines DNA-DNA-Hybrides um ca. 0,6°C pro 1 % Formamid. Es kann bis zu einer Konzentration von 50 % eingesetzt werden. Die Temperatur während der Hybridisierung kann dadurch, gegenüber einer wäßrigen Lösung, deutlich reduziert werden. Niedrigere Temperaturen bringen zusätzlich einen niedrigeren Verlust an DNA durch Ablösen von der Nitrocellulose-Membran mit sich. Außerdem wird die Hintergrundhybridisierung mit heterologer RNA reduziert. In Verbindung mit Nylon-Membranen bringt der Einsatz von Formamid sehr wahrscheinlich keine Vorteile. In Blot-Experimenten werden zunehmend auch nicht-Formamid-enthaltende Puffer entwickelt, wobei bestimmte Vorteile des Formamids durch andere Puffer nicht ausgeglichen werden können. Da die Hybridisierung von Nukleinsäuren in Formamid-haltigen Puffern zu sehr spezifischen Hybridenführt, sind weniger Waschschritte erforderlich (6).Eine Formamid-Prähybridisierungs-/Hybridisierungslösung setzt sich wie folgt zusammen: 5X SSC, 5X Denhardts-Lösung, 50 % (w/v) Formamid, 1 % (w/v) SDS unter Zusatz von 100 μg/ml Salmon Sperm DNA direkt vor Gebrauch (Ref. 8, S. 2.10.7 Supplement 35).

Literature

(1) Pinder, J.C. et al. (1974) Biochemistry 13, 5367-5373. Eigenschaften von RNA in Formamid. (2) Pinder, J.C. et al. (1974) Biochemistry 13, 5373-5378. Elektrophorese von RNA in Formamid. (3) Maniatis, T. & Efstratiadis, A (1980) Methods Enzymol. 65, 299-305Fraktionierung von niedermolekularer DNA oder RNA in Polyacrylamid-Gelen mit 98 % Formamid oder 7 M Harnstoff. (4) Meinkoth, J. & Wahl, G. (1984) Anal. Biochem. 138, 267-284. Hybridisierung von Nukleinsäuren, immobilisiert auf Membranen. (5) Chomczynski, P. (1992) Nucleic Acids Res. 20, 3791-3792. Lagerung von RNA in Formamid erhöht die Stabilität der RNA. (6) Cornish, E.C. et al. (1998) BioTechniques 25, 948-954. Überarbeitung der Southern-Blot - Methode: Einfluß der Hybridisierungspuffer. (7) Kafatos, F.C. et al. (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552. Bestimmung von Nukleinsäure-Sequenzhomologien mittels 'dot hybridization'. (8) Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) 2001. Currrent Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, N.Y.