Proteinase K - Lösung 20 mg/ml

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Über die Proteinase K
In der Molekularbiologie ist Proteinase K (EC 3.4.21.64, Protease K, Endopeptidase K, Tritirachium alkaline proteinase, Tritirachium album serine proteinase, Tritirachium album proteinase K) eine Serinprotease mit breitem Spektrum. Das Enzym wurde 1974 in Extrakten des Pilzes Engyodontium album (früher Tritirachium album) entdeckt. Proteinase K kann Haare (Keratin) verdauen, daher auch der Name "Proteinase K". Die vorherrschende Spaltstelle ist die Peptidbindung neben der Carboxylgruppe von aliphatischen und aromatischen Aminosäuren mit blockierten Alpha-Aminogruppen. Es wird häufig wegen seiner breiten Spezifität verwendet. Proteinase K gehört zur Peptidase-Familie S8 (Subtilisin). Das Molekulargewicht der Proteinase K beträgt 28.900 Dalton (28,9 kDa).

Aktivität der Proteinase K
Durch Calzium aktiviert, verdaut das Enzym Proteinase K Proteine bevorzugt nach hydrophoben Aminosäuren (aliphatische, aromatische und andere hydrophobe Aminosäuren). Kalziumionen beeinflussen zwar nicht die Aktivität des Enzyms, tragen aber zu seiner Stabilität bei. Die Proteine werden vollständig verdaut, wenn die Inkubationszeit lang und die Proteasekonzentration hoch genug ist. Werden die Calziumionen entfernt, verringert sich die Stabilität des Enzyms, aber die proteolytische Aktivität bleibt erhalten. Proteinase K hat zwei Bindungsstellen für Ca2+, die sich in der Nähe des aktiven Zentrums befinden, aber nicht direkt am katalytischen Mechanismus beteiligt sind. Die Restaktivität reicht aus, um Proteine zu verdauen, die normalerweise Nukleinsäurepräparate kontaminieren. Daher wird der Verdau mit Proteinase K für die Reinigung von Nukleinsäuren in der Regel in Gegenwart von EDTA durchgeführt (Hemmung von metallionenabhängigen Enzymen wie Nukleasen).

Stabilität von Proteinase K
Proteinase K ist über einen weiten pH-Bereich (4-12) stabil, wobei das pH-Optimum bei pH 8,0 liegt. Eine Erhöhung der Reaktionstemperatur von 37 °C auf 50-60 °C kann die Aktivität um ein Vielfaches steigern, ebenso wie die Zugabe von 0,5-1% Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Guanidiniumchlorid (3 M), Guanidiniumthiocyanat (1 M) und Harnstoff (4 M). Die oben genannten Bedingungen erhöhen die Aktivität der Proteinase K, indem sie ihre Substratspaltstellen besser zugänglich machen. Temperaturen über 65 °C, Trichloressigsäure (TCA) oder die Serinprotease-Inhibitoren AEBSF, PMSF oder DFP hemmen die Aktivität. Die Proteinase K wird nicht durch Guanidiniumchlorid, Guanidiniumthiocyanat, Harnstoff, Sarkosyl, Triton X-100, Tween 20, SDS, Citrat, Iodessigsäure, EDTA oder durch andere Serinprotease-Inhibitoren wie Nα-Tosyl-Lys Chlormethylketon (TLCK) und Nα-Tosyl-Phe Chlormethylketon (TPCK) gehemmt.

Anwendungen von Proteinase K
Proteinase K wird in der Molekularbiologie häufig verwendet, um Proteine zu verdauen und Verunreinigungen aus Nukleinsäurepräparaten zu entfernen. Durch Zugabe von Proteinase K zu Nukleinsäurepräparaten werden Nukleasen, die andernfalls die DNA oder RNA während der Reinigung abbauen könnten, schnell inaktiviert. Es ist für diese Anwendung sehr gut geeignet, da das Enzym in Gegenwart von Chemikalien, die Proteine denaturieren, wie SDS und Harnstoff, Chelatbildnern wie EDTA, Sulfhydrylreagenzien sowie Trypsin- oder Chymotrypsin-Inhibitoren aktiv ist. Proteinase K wird für die Zerstörung von Proteinen in Zelllysaten (Gewebe, Zellkulturzellen) und für die Freisetzung von Nukleinsäuren verwendet, da sie DNasen und RNasen sehr effektiv inaktiviert. Einige Beispiele für Anwendungen: Proteinase K ist sehr nützlich bei der Isolierung von hochnatürlichen, unbeschädigten DNAs oder RNAs, da die meisten mikrobiellen oder Säugetier-DNasen und RNasen durch das Enzym schnell inaktiviert werden, insbesondere in Gegenwart von 0,5-1% SDS. Die Aktivität des Enzyms gegenüber nativen Proteinen wird durch Denaturierungsmittel wie SDS stimuliert. Bei der Messung mit Peptidsubstraten hingegen hemmen Denaturierungsmittel das Enzym. Der Grund für dieses Ergebnis ist, dass die Denaturierungsmittel die Proteinsubstrate auffalten und sie für die Protease leichter zugänglich machen.

Inhibitoren der Proteinase K
Die Proteinase K besitzt zwei Disulfidbindungen, zeigt aber in Gegenwart von Reduktionsmitteln (z. B. 5 mM DTT) eine höhere proteolytische Aktivität, was darauf hindeutet, dass die vermutete Reduktion ihrer eigenen Disulfidbindungen nicht zu ihrer irreversiblen Inaktivierung führt. Proteinase K wird durch Serinprotease-Inhibitoren wie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Diisopropylfluorophosphat (DFP) oder 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid (AEBSF) gehemmt. Die Aktivität der Proteinase K wird durch die sulfhydrylmodifizierenden Reagenzien para-Chlormercuribenzoesäure (PCMB), N-alpha-Tosyl-L-lysyl-chlormethylketon (TLCK) oder N-alpha-Tosyl-l-phenylalaninchlormethylketon (TPCK) nicht beeinträchtigt, obwohl sie vermutlich gehemmt wird, wenn diese Reagenzien zusammen mit disulfidreduzierenden Reagenzien verwendet werden, die die normalerweise nicht verfügbaren Thiole der Proteinase K freilegen.

FAQs

Wie inaktiviert man Proteinase K?

Die Inaktivierung der Proteinase K ist vielleicht eine der häufigsten Fragen, die wir erhalten. Und die Antwort ist sehr einfach. Hitze ist eine weit verbreitete Methode zur Inaktivierung der Proteinase K. Während die Aktivität der Proteinase K mit der Temperatur zunimmt und bei etwa 65 ˚C optimiert ist, wird die Proteinase K durch Erhitzen auf 95 ˚C für 10 Minuten inaktiviert. Beachten Sie jedoch, dass das Erhitzen der Proteinase K das Enzym nicht vollständig inaktiviert. Bei dieser Methode bleibt immer eine kleine Menge an Aktivität übrig. Proteaseinhibitoren wie PMSF und AEBSF (Pefabloc®) können ebenfalls verwendet werden, um Proteinase K dauerhaft zu inaktivieren. Hinweis: Die tatsächliche Inaktivierungstemperatur ist umstritten und liegt zwischen 70 und 95 ˚C. Aufgrund von Rückmeldungen aus der Bevölkerung und umfangreichen Recherchen haben wir uns jedoch auf 95 ˚C als beste Temperatur für die Inaktivierung geeinigt.

Was ist die optimale Temperatur für die Aktivierung von Proteinase K?

Wie bereits unter Frage 1 erwähnt, nimmt die Aktivität der Proteinase K mit der Temperatur zu (bis zu einem bestimmten Punkt). Die optimale Temperatur für die Aktivität liegt zwischen 50-65 ˚C. Höhere Temperaturen fördern die Entfaltung der Proteine und erleichtern der Proteinase K den Abbau dieser Proteine. Aber die Optimierung der Proteinase K ist vielleicht nicht das Wichtigste bei Ihrem Verfahren. Manchmal erfordern spezielle Techniken angepasste Temperaturen, um die besten Gesamtergebnisse zu erzielen. Daher sollten Sie auch bedenken, dass der angegebene Temperaturbereich für die Aktivität der Proteinase K zwar groß ist, das Enzym aber auch bei Temperaturen zwischen ~20-65 ˚C noch aktiv ist, und dass diese große Temperaturflexibilität für ganz bestimmte Methoden, die Sie durchführen, nützlich sein kann. Bei höheren Temperaturen als 65 ˚C besteht die Gefahr, dass die Proteinase K inaktiviert wird.

Welche Beziehung besteht genau zwischen Proteinase K und Calcium/Kalzium?

Proteinase K bindet an zwei Ca 2+-Ionen, die dazu beitragen, die Stabilität des Enzyms aufrechtzuerhalten, insbesondere wenn es steigenden Temperaturen ausgesetzt ist. Calcium schützt die Proteinase K auch vor Autolyse. Calcium/Kalzium trägt zwar zur Aufrechterhaltung der Thermostabilität von Proteinase K bei, ist aber für die proteolytische Aktivität nicht erforderlich. Laut Richard Tullis und Harvey Rubin wird diese Beziehung noch interessanter, wenn DNase I beteiligt ist. Es ist bekannt, dass Proteinase K DNasen und RNasen inaktiviert, aber wenn DNase I in Gegenwart von Ca2+ ist, ist sie vor Proteinase K geschützt (Konzentration von 1 mg/mL). Die RNase hingegen wird unabhängig davon, ob sie in Gegenwart von Ca2+ ist oder nicht, inaktiviert. Ihre Ergebnisse legen eine Methode zur Behandlung kontaminierter RNase ohne DNaseI oder zur Isolierung hochpolymerisierter RNA nahe.

Inaktiviert EDTA die Proteinase K?

Diese Frage scheint ebenfalls häufig aufzutreten, wenn es um Proteinase K geht. Chelatoren wie EDTA oder EGTA haben keinen direkten Einfluss auf die Enzymaktivität der Proteinase K. Der Grund für die Verwendung von EDTA mit Proteinase K während der DNA- oder RNA-Aufreinigung ist häufig die Entfernung von Calcium Kalzium (siehe auch Frage Nr. 3). Da Calcium/Kalzium jedoch mit der Stabilität der Proteinase K zusammenhängt, kann sich die Zugabe von EDTA auf das Kalzium auswirken und somit die Aktivität der Proteinase K bis zu einem gewissen Grad verringern.

Was sind die Aktivatoren der Proteinase K?

Zu den Proteinase-K-Aktivatoren gehören SDS (Natriumdodecylsulfat) und Harnstoff. Im Allgemeinen wird die Proteinase K in Puffern, die diese Aktivatoren enthalten, stabiler und aktiver.
Wie ist die Proteinase K an der Zelllyse beteiligt? Um diese Frage zu beantworten, muss man zunächst wissen, was Proteinase K ist. Es handelt sich um eine Breitspektrum-Protease, die in der Lage ist, ein breites Spektrum nativer Proteine zu verdauen (weitere Einzelheiten dazu finden Sie weiter unten). Bei der Zelllyse, insbesondere bei der anschließenden DNA-Isolierung und -Reinigung, kann die Proteinase K Teil des Lyse-Schrittes sein, indem sie Oberflächenproteine verdaut. Im weiteren Verlauf des Verfahrens, wenn es an der Zeit ist, die Kerne in einem Puffer mit Proteinase K zu resuspendieren und zu lysieren, trägt die Proteinase K zum Verdau von Proteinen bei, die ansonsten die Probe abbauen würden.

Warum wird in vielen Rezepten für DNA-Extraktionspuffer die Verwendung von Proteinase K und RNase gefordert?

Diese Frage taucht immer wieder auf, weil der Vorschlag wie ein Widerspruch erscheint. Es ist bekannt, dass Proteinase K RNasen verdaut. Warum also sollte man die beiden zusammen in einen Lysepuffer geben? Zunächst einmal wollen Sie die RNase zugeben, weil sie kontaminierende RNA während der DNA-Isolierung abbauen würde. Und Sie wollen Proteinase K verwenden, weil sie schädliche Proteine, DNasen und RNasen abbauen kann. Die Antwort auf diese Frage ist eine Frage des richtigen Zeitpunkts und der Optimierung. Einige Forscher schlagen vor, zuerst die RNase hinzuzufügen und ihr Zeit zum Wirken zu geben. Dann können Proteinase K und SDS hinzugefügt werden, um unerwünschte Proteine abzubauen. Bei einigen Protokollen müssen Sie SDS, Proteinase K und RNase für eine bestimmte Zeit bei 37 ˚C inkubieren. Da die Aktivität der Proteinase K bei dieser Temperatur nicht so stark optimiert ist, hat die RNase dadurch wahrscheinlich mehr Zeit, zu arbeiten. Spätere Schritte im Protokoll schlagen eine zweite Inkubation bei 55 ˚C für einen längeren Zeitraum vor, was eine optimalere Temperatur für die Aktivität der Proteinase K wäre und ihr erlauben würde, andere unerwünschte Proteine zu verdauen.

Für welche Anwendungen wird Proteinase K verwendet?

Proteinase K ist eine Serinprotease mit breitem Wirkungsspektrum, die zur Klasse der Subtilisin-ähnlichen Proteasen gehört (es gibt zwei Arten von Serinproteasen, chymotrypsinähnliche und subtilisinähnliche). Als Breitspektrum-Protease wird sie hauptsächlich für die Isolierung von Nukleinsäuren verwendet: genomische DNA, zytoplasmatische RNA, hochnative DNA und RNA usw. Sie ist für diese Anwendungen ideal, da Proteinase K in der Lage ist, Proteine abzubauen und DNasen und RNasen zu inaktivieren, die andernfalls eine gewünschte DNA- oder RNA-Probe abbauen würden. Um die Aufzählung zu vereinfachen, wird Proteinase K verwendet für: Verdauung von unerwünschten Proteinen in molekularbiologischen Anwendungen, Beseitigung von Endotoxinen, die an kationische Proteine wie Lysozym und RNaseA gebunden sind, Entfernung von Nukleasen für die In-situ-Hybridisierung, Prionenforschung in Bezug auf TSE (transmissible spongiforme Enzephalopathien), Protease-Footprinting, Mitochontriale Isolierung, Isolierung von genomischer DANN, Isolierung von zytoplasmatischer RNA, Isolierung hochnativer DNA oder RNA.

Wie sollte Proteinase K gelagert werden/ wie lange ist Proteinase K haltbar?

Stammlösung: Normalerweise sind Stammlösungen bei -20 ˚C für bis zu 1 Jahr haltbar. Lyophilisiertes Pulver: Normalerweise trocken bei -20 ˚C bis zu 2 Jahre. Es gelten aber die Bestimmungen auf den Analysenzertifikaten des jeweiligen Herstellers, die von dieser Aussage abweichen können.

In was kann Proteinase K gelöst werden / Wie löst man Proteinase K?

Die Proteinase K ist sehr gut wasserlöslich und kann auch in Tris oder PBS gelöst werden. Bei der Arbeit mit PBS kann es jedoch etwas schwierig sein, was möglicherweise auf den pH-Wert zurückzuführen ist (noch im optimalen Bereich, aber am unteren Ende dieses Bereichs). In der Regel hilft die Zugabe von Proteinase-K-Pulver in kleinen Mengen beim Einrühren in die Lösung, um es in PBS aufzulösen.

Wie inaktiviere ich Nukleasen mit Proteinase K?

Die Proteinase K ist dafür bekannt, dass sie Nukleinsäuren vor dem Proteinabbau schützt. Dies geschieht, weil Proteinase K in der Lage ist, Proteine zu verdauen, die normalerweise Ihre Probe beschädigen würden. In diesem Protokoll wird näher erläutert, wie Sie Proteinase K zur Inaktivierung von Nukleasen während Ihrer Extraktionsverfahren verwenden.

Gibt es eine Alternative zur Verwendung von Proteinase K bei DNA-Extraktionen?

Der Vorteil der Verwendung von Proteinase K bei der DNA-Extraktion besteht darin, dass sie eine Vielzahl von schädlichen Nukleasen abbauen kann. Sie eignet sich auch hervorragend für den Verdau von Oberflächenproteinen auf der Zellmembran. Wenn diese Frage jedoch speziell auf die Isolierung von DNA aus anderen Proteinen abzielt, ist die Phenol-Chloroform-Extraktion eine weitere Option, die zur Entfernung von Proteinen aus einer Lösung geeignet ist. Diese Methode ist jedoch giftiger.

Was hat Proteinase K mit Prionenerkrankungen oder TSE zu tun?

Proteinase K ist an der Unterscheidung zwischen dem normalen PrP C (Prionprotein/Protease-resistentes Protein) und PrPSC (krankheitsverursachende Isoform) beteiligt. Sowohl PrPC als auch PrPSC haben das gleiche Molekulargewicht, PrPSC ist jedoch resistent gegen Proteinase K. Proben, die beide enthalten könnten, werden mit Proteinase K behandelt, wodurch PrPC eliminiert und PrPSC in PrPRES umgewandelt wird, das ein geringeres Molekulargewicht hat und pelletiert und somit unterschieden werden kann.

Wie hoch ist das Molekulargewicht von Proteinase K?

Das Molekulargewicht der Proteinase K beträgt 28,5 kDa.

Welches ist der optimale pH-Wert für Proteinase K?

Die Proteinase K ist bei einem pH-Wert zwischen 7,5 und 12,0 aktiv.

Wie lautet die Primärsequenz für Proteinase K?

GAAQTNAPWGLARISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEASHPEFEGRAQMVKTYYYSSRDGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGQYSTIIAGMDFVASDKNNRNCPKGVVASLSLGGGYSSSVNSAAARLQ SSGVMVAVAAGNNNADARNYSPASEPSVCTVGASDRYDRRSSFSNYGSVLDIFGPGTSILSTWIGGSTRSISGTSMATPHVAGLAAYLMTLGKTTAASACRYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQA

Was ist Proteinase K?

Wir haben beschlossen, diese Frage für den Schluss aufzuheben, vor allem weil die Antwort leicht auf unserer Website zu finden ist und auf dieser Seite angedeutet wird. Dennoch verdient die Frage hier unbedingt einen eigenen Platz. Proteinase K ist eine Serinprotease mit breitem Wirkungsspektrum, die zur Familie der Subtilisine gehört. Sie ist in der Forschung für ihre Fähigkeit bekannt, RNasen und DNasen zu inaktivieren, die die gewünschten Nukleinsäureproben während der Extraktion schädigen würden. Ihren Namen erhielt sie aufgrund ihrer ursprünglich entdeckten Fähigkeit, Keratin zu hydrolysieren.

Warum wird Proteinase K bei der DNA-Extraktion verwendet?

Proteinase K wird bei der DNA-Extraktion verwendet, um viele vorhandene kontaminierende Proteine zu verdauen. Sie baut auch Nukleasen ab, die bei der DNA-Extraktion vorhanden sein können, und schützt die Nukleinsäuren vor Nuklease-Angriffen.

Was sind die Anwendungen von Proteinase K?

Anwendungen für Next Generation Sequencing (NGS) und Microarray-Technologien: Nukleinsäurereinigung durch Inaktivierung von Nukleasen bei der Extraktion von DNA und RNA aus Hefe-, Bakterien-, Säugetierzell- und Pflanzenzell-Lysaten, Verbessert die Klonierungseffizienz von PCR-Produkten, Probenvorbereitung für die Quantifizierung von DNA-Adduktmengen durch Beschleuniger-Massenspektrometrie, Inaktivierung von Enzymcocktails in Ribonuklease-Schutz-Assays, Zusatz zu Extraktionsverfahren zur Optimierung der RNA-Ausbeute aus primären Brusttumoren für Microarray-Studien. Anwendungen für die Molekularbiologie: Nachweis von Proteinen der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie, die einzigartig resistent gegen proteolytischen Abbau sind. Gewebeverdauung (Denaturierung von Proteinen) als alternative Probenvorbereitung für die quantitative Analyse mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie. Spezifische Modifizierung von Zelloberflächenproteinen zur Analyse von Membranstrukturen für die Proteinlokalisierung, Generierung von Proteinfragmenten zur Charakterisierung von Funktionsstudien.

Was sind die Richtlinien für die Verwendung von Proteinase K?

Isolierung von DNA mit hohem Molekulargewicht: Chromosomale DNA, die in Agarosepfropfen eingebettet wurde, kann mit Proteinase K behandelt werden, um die für den Verdau der DNA verwendeten Restriktionsenzyme zu inaktivieren. Das Enzym wird für diese Methode in einer Konzentration von 1 mg/mL in einem Puffer mit 0,5 M EDTA und 1% N-Lauroylsarkosin (v/v) verwendet. Inkubieren Sie 24-48 Stunden bei 37 °C. Isolierung von Plasmid- und genomischer DNA: Genomische oder Plasmid-DNA kann aus mit flüssigem Stickstoff gefrorenen Zellen oder kultivierten Zellen mit Hilfe von Proteinase K isoliert werden. 50-100 mg Gewebe oder 1x108 Zellen in 1 ml Puffer mit 0,5% SDS (w/v) mit Proteinase K in einer Konzentration von 1 mg/mL 12-18 Stunden lang bei 50 °C inkubieren. Isolierung der RNA: Für die Isolierung der zytoplasmatischen RNA das Zelllysat zentrifugieren, den Überstand entfernen und 200 ug/ml Proteinase K und SDS auf 2% (w/v) zugeben. 30 Minuten bei 37 °C inkubieren. Die Gesamt-RNA kann isoliert werden, indem das Lysat vor der Behandlung mit dem Enzym durch eine an einer Spritze befestigte Nadel gezogen wird. Inaktivierung von RNasen, DNasen und Enzymen in Reaktionen: Proteinase K ist in einer Vielzahl von Puffern aktiv. Das Enzym sollte in einem Verhältnis von etwa 1:50 (w/w, Proteinase K: Enzym) verwendet werden. Die Inkubation erfolgt bei 37 °C für 30 Minuten.

Warum wird der Verdau bei 50 °C durchgeführt?

Durch die Erhöhung der Temperatur auf 50 °C werden einige Proteine entfaltet, so dass sie von der Proteinase K leichter abgebaut werden können. Das Enzym ist stabil und seine Aktivität wird durch die Zugabe von Denaturierungsmitteln wie SDS und Harnstoff stark erhöht.

Wie lässt sich Proteinase K am schnellsten und effektivsten inaktivieren?

Wie bei den meisten Proteinen besteht die wirksamste Methode zur Inaktivierung des Enzyms darin, die Temperatur zu erhöhen oder den pH-Wert deutlich zu verändern. Proteinase K wird durch Hitze inaktiviert (z. B. durch Inkubation bei 55 °C).

Wie kann man feststellen, ob das Enzym Proteinase K funktioniert?

Um festzustellen, ob das Enzym funktioniert, können Sie die folgenden 2 Schritte durchführen: Ermitteln Sie, wie viele Mikromol des p-Nitroanilids pro Minute produziert werden. Dann dividieren Sie durch die Gesamtmenge des Proteins in der Lösung. So können Sie die spezifische Aktivität des Enzyms bestimmen = Einheiten (eine Einheit entspricht 1 Mol des produzierten p-Nitroanilids pro Minute), spezifische Aktivität = Einheiten der Enzymaktivität/mg Gesamtprotein.

Wo spaltet die Proteinase K?

Proteinase K spaltet Peptidbindungen neben der Carboxylgruppe von N-substituierten hydrophoben, aliphatischen und aromatischen Aminosäuren. Sie spaltet auch Peptidamide.

Wie lange ist Proteinase K haltbar?

Proteinase K ist 6 Monate haltbar, wenn es an einem trockenen Ort bei 4-8 °C gelagert wird, da es sehr stabil ist. Kurzfristige Lagerung bei Raumtemperatur beeinträchtigt die Aktivität und Stabilität von Proteinase K nicht. Es gelten aber die Bedingungen der Hersteller auf den Analysezertifikaten.

Welche Rolle spielt Proteinase K in der Covid-19 Analytik?

Proteinase K spielt eine wichtige Rolle in der Probenvorbereitung für PCR-Tests zum Covid-19 Nachweis. Die Funktion der Proteinase K ist hierbei der Verdau von Proteinen in der Probe, dabei im Speziellen die Nukleasen, die andernfalls den Abbau von DNA und RNA in der Probe begünstigen und somit das finale Testergebnis verfälschen würden.

Wo kommt Proteinase in der Natur vor?

Proteinase wurde erstmalig 1974 in den Extrakten des Pilzes Engyodontium album (früher Tritirachium album) entdeckt.

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