DNasa I

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La desoxirribonucleasa I (DNasa I) del páncreas de vacuno es una endonucleasa (glicoproteína) que escinde preferentemente el enlace fosfodiéster del ADN detrás de los nucleótidos de pirimidina. El resultado es un polinucleótido con un 5'-fosfato y un grupo OH libre en la posición 3'. La DNasa I escinde el ADN monocatenario y de doble cadena, así como la cromatina. La especificidad de la reacción enzimática (ruptura de una sola cadena o de dos cadenas) viene determinada por los iones disponibles. En presencia de Mg2+ se generan muescas de una sola cadena y en presencia de Mn2+ rupturas de doble cadena. El pH óptimo de la DNasa I es de 7,8 y se activa con cationes divalentes. La máxima activación requiere la presencia de Mg2+ y Ca2+ adicionales. Los iones de calcio (5 mM) protegen a la DNasa I de la digestión proteolítica. La inhibición se consigue con citrato, si la activación se realiza con magnesio, pero no si el manganeso ha sido el activador. Además se inhibe por quelantes como el EDTA y el SDS o el β-mercaptoetanol.La enzima se utiliza en técnicas de biología molecular como la digestión del ADN, en la purificación del ARN (ref. 2 Suppl. 1 pp. 4) o la generación de "nicks aleatorios" para la "traducción de nicks" (ref. 2 Suppl. 9 pp. 3.5.4-6) o los ensayos de "huella" (ref. 2 Suppl. 7 capítulo 12.4) o las investigaciones sobre la cromatina (ref. 2 Suppl. 48 capítulo 21.4.1).Definición de unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima que provoca un aumento de la absorbancia a 260 nm de 0,001 por minuto a 25°C según el método de Kunitz. La DNasa I es fácilmente soluble, por ejemplo, en cloruro sódico 0,15 M o en el tampón de reacción (por ejemplo, 50 mM Tris - Cl, pH 7,5; 10 mM MgCl₂ (roturas de una sola cadena) y 10 mM MnCl₂ (roturas de dos cadenas), respectivamente; 50 μg/ml BSA; ref. 2 Suppl. 8 página 3.12.5). Para el almacenamiento, disolver la DNasa I en 50% de glicerol (p/v); 20 mM Tris - Cl, pH 7,5; 1 mM MgCl₂. Por razones de estabilidad, las concentraciones deben ser de al menos 1 mg/ml (La solubilidad máxima es del 10%). Esta solución es estable durante más de un año (ref. 2 Suppl. 8 página 3.12.5). La forma liofilizada es estable durante 2 - 5 años si se conserva a +4°C. Si una solución está libre de proteasas, la DNasa I no perderá actividad significativa a pH 5 - 7 y 62°C durante 5 horas. La enzima puede ser inactivada por calor (10 minutos a 99°C).DNasa I libre de RNasa: Disolver la DNasa I a 1 mg/ml en ácido yodoacético 0,1 M más acetato de sodio 0,15 M a un pH final de 5,3. La solución se calienta 40 minutos a 55°C y se enfría. Por último, se añade a la solución 1 M de CaCl₂ hasta alcanzar 5 mM. Almacenar congelada en pequeñas alícuotas (según la ref. 2 página 3.12.6 Suplemento 8).

Literature

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