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Hay dos aplicaciones principales del SSC. Este tampón se utiliza para la desnaturalización del ADN para el cribado de bibliotecas de ADN (por ejemplo, genómica, ADNc o biblioteca YAC). La sonda para el cribado de la biblioteca sólo se unirá al ADN inmovilizado de la biblioteca, si este ADN está en un estado monocatenario. La concentración de trabajo utilizada habitualmente es SSC 2X (Ref. 4, p. 6.1.3). La segunda aplicación importante es el uso de SSC como tampón de transferencia cuando se hace un blot de ADN después de la electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida sobre membranas de nitrocelulosa o nylon (Southern-Blot). En caso de utilizar membranas de nitrocelulosa, debe emplearse una concentración de SSC elevada (20X; alta fuerza iónica), ya que los fragmentos de ADN más pequeños podrían perderse en concentraciones de SSC 10X o inferiores. Se puede esperar un buen resultado para las membranas de nylon utilizando 20X y 10X de SSC. Dependiendo de la membrana de nylon, otras condiciones pueden dar lugar a mejores tasas de hibridación (por ejemplo, membranas con carga positiva con un tampón de transferencia alcalino). Si se utiliza como tampón de transferencia, no es necesario filtrar el SSC, pero para soluciones de hibridación, es esencial filtrar el SSC antes de su uso. El tampón SSC de PanReac AppliChem se suministra filtrado. El poder tampón del SSC puede aumentarse añadiendo pirofosfato sódico al 0,3% (p/v). En las referencias 3 y 4 se describen en detalle varias técnicas: Ref. 3: Southern blot (p. 6.41-6.58), Northern blot (p. 7.36-7.44), Dot-blot y Slot-blot (p. 7.48-7.50), Ref. 4: Southern blot (p. 2.9.1-2.9.15 Suplemento 21) Dot-blot y Slot-blot (pp. 2.9.15-2.9.20 Suplemento 21) Análisis de hibridación de DNA (p. 2.10.1-2.10.16 Suplemento 21) Cribado de bibliotecas de ADN recombinante (Capítulo 6; Hibridación con sondas radiactivas p. 6.3.1-6.3.6; Uso de oligonucleótidos sintéticos como sondas 6.4.1-6.4.3 Suplemento 13).
Literature
(1) Southern, E.M. (1975) J. Mol. Biol. 98, 503-517. Detección de secuencias específicas de fragmentos de ADN tras la electroforesis en gel. (2) Chomczynski, P. (1992) Anal. Biochem. 201, 134-139. Transferencia capilar alcalina para blotting de ADN y ARN. (3) Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Página A1.14. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. (4) Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (2001) Current Protocols in Molecular Biology. Página A.2.5 (Suppl. 40) Greene Publishing & Wiley-Interscience, Nueva York. (5) Nagamine, Y. et al. (1980) Nucleic Acids Res. 8, 2453-2460. Blotting selectivo de fragmentos de ADN de restricción en nitrocelulosa a bajas concentraciones de sal.
