Proteinase K, lyophilized

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Informazioni sulla proteinasi K
In biologia molecolare, la proteinasi K (EC 3.4.21.64, proteasi K, endopeptidasi K, proteinasi alcalina di Tritirachium, proteinasi serina di Tritirachium album, proteinasi K di Tritirachium album) è una proteasi serinica ad ampio spettro. L'enzima è stato scoperto nel 1974 negli estratti del fungo Engyodontium album (ex Tritirachium album). La proteinasi K può digerire i capelli (cheratina), da cui il nome "proteinasi K". Il sito di scissione predominante è il legame peptidico vicino al gruppo carbossilico degli amminoacidi alifatici e aromatici con gruppi alfa-ammino bloccanti. È spesso usato per la sua ampia specificità. La proteinasi K appartiene alla famiglia delle peptidasi S8 (subtilisina). Il peso molecolare della proteinasi K è di 28.900 dalton (28,9 kDa).

Attività della proteinasi K
Attivato dal calcio, l'enzima proteinasi K digerisce le proteine preferibilmente per gli aminoacidi idrofobici (alifatici, aromatici e altri aminoacidi idrofobici). Gli ioni di calcio non influenzano l'attività dell'enzima, ma contribuiscono alla sua stabilità. Le proteine sono completamente digerite se il tempo di incubazione è lungo e la concentrazione di proteasi è sufficientemente alta. Se gli ioni di calcio vengono rimossi, la stabilità dell'enzima è ridotta, ma l'attività proteolitica è mantenuta. La proteinasi K ha due siti di legame per il Ca2+, che sono vicini al sito attivo, ma non sono direttamente coinvolti nel meccanismo catalitico. L'attività residua è sufficiente per digerire le proteine che normalmente contaminano le preparazioni di acido nucleico. Pertanto, la digestione della proteinasi K per la purificazione dell'acido nucleico viene solitamente eseguita in presenza di EDTA (inibizione degli enzimi dipendenti dagli ioni metallici come le nucleasi).

Stabilità della proteinasi K
La proteinasi K è stabile in un ampio intervallo di pH (4-12), l'ottimale è pH 8,0. L'aumento della temperatura di reazione da 37 °C a 50-60 °C può aumentare l'attività di diverse volte, così come l'aggiunta di 0,5-1 % di sodio dodecil solfato (SDS) o di cloruro di guanidinio (3 M), tiocianato di guanidinio (1 M) e urea (4 M). Le condizioni di cui sopra aumentano l'attività della proteinasi K rendendo i suoi siti di scissione del substrato più accessibili. Temperature superiori a 65 °C, acido tricloroacetico (TCA) o gli inibitori della serina proteasi AEBSF, PMSF o DFP inibiscono l'attività. La proteinasi K non è inibita da cloruro di guanidinio, tiocianato di guanidinio, urea, sarcosile, Triton X-100, Tween 20, SDS, citrato, acido iodoacetico, EDTA o altri inibitori della serina proteasi come Nα-tosyl-Lys cloromethylketone (TLCK) e Nα-tosyl-Phe chloromethylketone (TPCK).

Applicazioni della proteinasi K
La proteinasi K è ampiamente utilizzata in biologia molecolare per digerire le proteine e rimuovere le impurità dalle preparazioni di acido nucleico. Aggiungendo la proteinasi K alle preparazioni di acido nucleico, le nucleasi che potrebbero altrimenti degradare il DNA o l'RNA durante la purificazione vengono rapidamente inattivate. È adatto a questa applicazione perché l'enzima è attivo in presenza di sostanze chimiche denaturanti per le proteine come SDS e urea, agenti chelanti come EDTA, reagenti al solfuro di idrogeno e inibitori di tripsina o chimotripsina. La proteinasi K è usata per la distruzione delle proteine nei lisati cellulari (tessuti, cellule di coltura cellulare) e per il rilascio di acidi nucleici, poiché inattiva le DNasi e le RNasi con alta efficienza. Alcuni esempi di applicazioni: La proteinasi K è molto utile nella purificazione di DNA o RNA altamente naturale e non danneggiato, poiché la maggior parte delle DNasi e RNasi microbiche o dei mammiferi sono rapidamente inattivate dall'enzima, specialmente in presenza di 0,5-1% di SDS. L'attività dell'enzima verso le proteine native è stimolata da denaturanti come l'SDS. Al contrario, quando si misura con substrati peptidici, i denaturanti inibiscono l'enzima. La ragione di questo risultato è che i denaturanti dispiegano i substrati proteici e li rendono più accessibili alla proteasi.

Inibitori della proteinasi K
La proteinasi K ha due legami disolfuro, ma mostra una maggiore attività proteolitica in presenza di agenti riducenti (ad esempio 5 mM DTT), indicando che la presunta riduzione dei propri legami disolfuro non porta alla sua inattivazione irreversibile. La proteinasi K è inibita da inibitori della serina proteasi come il fluoruro di fenilmetilsolfonile (PMSF), il diisopropil fluorofosfato (DFP) o il 4-(2-aminoetil)benzenesulfonil fluoruro (AEBSF). L'attività della proteinasi K non è influenzata da reagenti che modificano il solfito come l'acido para-cloromercuribenzoico (PCMB), il N-alfa-tosyl-L-lisyl chloromethyl ketone (TLCK) o il N-alfa-tosyl-l-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK), anche se è probabile che venga inibita quando questi reagenti vengono utilizzati insieme a reagenti disolfuro riducenti che espongono i tioli normalmente non disponibili della proteinasi K.

FAQs

Come viene inattivata la proteinasi K?

L'inattivazione della proteinasi K è forse una delle domande più comuni che riceviamo. E la risposta è molto semplice. Il calore è un metodo comunemente usato per inattivare la proteinasi K. Mentre l'attività della proteinasi K aumenta con la temperatura ed è ottimizzata a circa 65 ˚C, il riscaldamento a 95 ˚C per 10 minuti inattiva la proteinasi K. Tuttavia, va notato che il riscaldamento della proteinasi K non inattiva completamente l'enzima. Una piccola quantità di attività rimane sempre con questo metodo. Gli inibitori della proteasi come PMSF e AEBSF (Pefabloc®) possono anche essere usati per inattivare la proteinasi K in modo permanente. Nota: La temperatura di inattivazione effettiva è controversa e varia da 70 a 95 ˚C. Tuttavia, sulla basi dei commenti del pubblico e di un'ampia ricerca, abbiamo deciso che la migliore temperatura per l'inattivazione è 95 ˚C.

Qual è la temperatura ottimale per l'attivazione della proteinasi K?

Come menzionato nella domanda 1, l'attività della proteinasi K aumenta con la temperatura (in una certa misura). La temperatura ottimale per l'attività è tra 50-65 ˚C. Le temperature più alte favoriscono la scissione delle proteine e rendono più facile per la proteinasi K degradare le proteine. Ma l'ottimizzazione della proteinasi K potrebbe non essere la parte più importante del tuo processo. A volte le tecniche speciali richiedono temperature adattate per ottenere i migliori risultati complessivi. Pertanto, dovresti anche tenere a mente che, sebbene l'intervallo di temperatura riportato per l'attività della proteinasi K sia ampio, l'enzima è ancora attivo a temperature tra ~20-65 ˚C, e che questa ampia flessibilità di temperatura può essere utile per metodi molto specifici che stai eseguendo. A temperature superiori a 65 ˚C, c'è il rischio che la proteinasi K diventi inattiva.

Qual è esattamente la relazione tra la proteinasi K e il calcio?

La proteinasi K lega due ioni Ca2+ che aiutano a mantenere la stabilità dell'enzima, specialmente quando è esposto a temperature elevate. Il calcio protegge anche la proteina K dall'autolisi. Il calcio/calore aiuta a mantenere la termostabilità della proteinasi K, ma non è necessario per l'attività proteolitica. Secondo Richard Tullis e Harvey Rubin, questa relazione diventa ancora più interessante quando è coinvolta la DNasi I. La proteinasi K è nota per inattivare le DNasi e le RNasi, ma quando la DNasi I è in presenza di Ca2+, è protetta dalla proteinasi K (concentrazione di 1 mg/mL). La RNasi, d'altra parte, è inattivata sia che il Ca2+ sia presente o meno. I tuoi risultati suggeriscono un metodo per trattare la RNasi contaminata senza DNasiI o per purificare l'RNA altamente polimerizzato.

L'EDTA inattiva la proteinasi K?

Questa domanda sembra venire fuori spesso anche quando si parla di proteinasi K. I chelanti come EDTA o EGTA non hanno alcun effetto diretto sull'attività enzimatica della proteinasi K. La ragione per usare l'EDTA con la proteinasi K durante la purificazione del DNA o dell'RNA è di solito per rimuovere il calcio (vedi anche la domanda n. 3). Tuttavia, poiché il calcio/calcemia è legato alla stabilità della proteinasi K, l'aggiunta di EDTA può influenzare il calcio e quindi ridurre l'attività della proteinasi K in una certa misura.
Cosa sono gli attivatori della proteinasi K? Gli attivatori della proteinasi K sono SDS (sodio dodecil solfato) e urea. In generale, la proteinasi K diventa più stabile e attiva nei buffer contenenti questi attivatori.

In che modo la proteinasi K gioca un ruolo nella lisi cellulare? Per rispondere a questa domanda, dobbiamo prima sapere cos'è la proteinasi K. È una proteasi ad ampio spettro in grado di digerire una vasta gamma di proteine native (vedi sotto per i dettagli). Nella lisi cellulare, specialmente nel successivo isolamento e purificazione del DNA, la proteinasi K può far parte della fasi di lisi digerendo le proteine di superficie. Più tardi nel processo, quando arriva il momento di risospendere e lisciare i nuclei in un tampone contenente proteinasi K, la proteinasi K contribuisce alla digestione delle proteine che altrimenti degraderebbero il campione.

Perché molte ricette per i buffer di estrazione del DNA richiedono l'uso di proteinasi K e RNasi?

Questa domanda si ripropone continuamente perché il suggerimento sembra una contraddizione. La proteinasi K è nota per digerire le RNasi. Allora perché mettere le due cose insieme in un tampone di lisi? Prima di tutto, vuoi aggiungere la RNasi perché degraderebbe l'RNA contaminante durante la purificazione del DNA. E vuoi usare la proteinasi K perché può degradare le proteine dannose, le DNasi e le RNasi. La risposta a questa domanda è una questione di tempi e di ottimizzazione. Alcuni ricercatori suggeriscono di aggiungere prima la RNasi e darle il tempo di funzionare. Proteinasi K e SDS possono poi essere aggiunti per degradare le proteine indesiderate. Alcuni protocolli richiedono l'incubazione di SDS, proteinasi K e RNasi a 37 ˚C per un certo tempo. Poiché l'attività della proteinasi K non è così ottimizzata a questa temperatura, questo probabilmente dà alla RNasi più tempo per lavorare. I passi successivi del protocollo suggeriscono una seconda incubazione a 55 ˚C per un periodo di tempo più lungo, che sarebbe una temperatura ottimale per l'attività della proteinasi K e le permetterebbe di digerire altre proteine indesiderate.

Per quali applicazioni si usa la proteinasi K?

La proteinasi K è una proteasi serinica ad ampio spettro che appartiene alla classe delle proteasi simili alla subtilisina (ci sono due tipi di proteasi seriniche, simili alla chimotripsina e simili alla subtilisina). Essendo una proteasi ad ampio spettro, viene utilizzata principalmente per l'isolamento di acidi nucleici: DNA genomico, RNA citoplasmatico, DNA e RNA ad alta natività, ecc. È ideale per queste applicazioni perché la proteinasi K è in grado di degradare le proteine e inattivare le DNasi e le RNasi che altrimenti degraderebbero un campione di DNA o RNA desiderato. Per semplificare l'elenco, si usa la proteinasi K: digestione di proteine indesiderate in applicazioni di biologia molecolare, rimozione di endotossine legate a proteine cationiche come il lisozima e la RNasiA, rimozione di nucleasi per l'ibridazione in situ, ricerca sui prioni relativa alle TSE (encefalopatie spongiformi trasmissibili), footprinting delle proteasi, purificazione di mitocontri, purificazione di DNA genomico, purificazione di RNA citoplasmatico, purificazione di DNA o RNA ad alta natività.

Come deve essere conservata la proteinasi K/qual è la durata di conservazione della proteinasi K?

Soluzione stock: normalmente le soluzioni stock sono stabili a -20 ˚C fino a 1 anno. Polvere liofilizzata: normalmente essiccata a -20 ˚C per un massimo di 2 anni. Tuttavia, si applicano le disposizioni dei rispettivi certificati di analisi dei produttori, che possono differire da questa dichiarazione. In cosa si può sciogliere la proteinasi K / Come sciogliere la proteinasi K? La proteinasi K è molto solubile in acqua e può anche essere dissolta in Tris o PBS. Tuttavia, quando si lavora con il PBS può essere un po' difficile, forse a causa del pH (ancora nell'intervallo ottimale, ma all'estremità inferiore di questo intervallo). Di solito, l'aggiunta di proteinasi K in polvere in piccole quantità quando la si agita nella soluzione aiuta a dissolverla nel PBS.

Come vengono inattivate le nucleasi dalla proteinasi K?

La proteinasi K è nota per proteggere gli acidi nucleici dalla degradazione delle proteine. Questo accade perché la proteinasi K è in grado di digerire le proteine che normalmente danneggerebbero il tuo campione. Questo protocollo spiega più in dettaglio come usare la proteinasi K per inattivare le nucleasi durante le tue procedure di estrazione.

Esiste un'alternativa all'uso della proteinasi K nelle estrazioni di DNA?

Il vantaggio di usare la proteinasi K nell'estrazione del DNA è che può degradare una varietà di nucleasi dannose. È anche eccellente per digerire le proteine di superficie della membrana cellulare. Tuttavia, se questa domanda è specificamente intesa a isolare il DNA da altre proteine, l'estrazione fenolo-cloroformio è un'altra opzione adatta per rimuovere le proteine da una soluzione. Tuttavia, questo metodo è più tossico.

Cosa ha a che fare la proteinasi K con le malattie da prioni o le TSE?

La proteinasi K è coinvolta nella distinzione tra la PrP C normale (proteina prionica/resistente) e la PrPSC (isoforma che causa la malattia). Sia PrPC che PrPSC hanno lo stesso peso molecolare, ma PrPSC è resistente alla proteinasi K. I campioni che potrebbero contenere entrambi sono trattati con la proteinasi K, che rimuove la PrPC e converte la PrPSC in PrPRES, che ha un peso molecolare inferiore e può essere staccata e quindi distinta.

Qual è il peso molecolare della proteinasi K?

Il peso molecolare della proteinasi K è di 28,5 kDa.

Qual è il valore di pH ottimale per la proteinasi K?

La proteinasi K è attiva a un pH compreso tra 7,5 e 12,0.

Qual è la sequenza primaria della proteinasi K?

GAAQTNAPWGLARISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEASHPEFEGRAQMVKTYYSSRDGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGYSTIIAGMDFVASDKNNRNCPVVASLSLGGGYSVNSAAARLQSSGVMVAAGNNADARNYSPASIPSVCTVGASDRYRSSFSNYGSVLDIFGPGTSILSTWIGGSTRSISGTSMATPHVAGLAAYLMTLGKTTAASACRYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQA

Cos'è la proteinasi K?

Abbiamo deciso di lasciare questa domanda alla fine, soprattutto perché la risposta si trova facilmente sul nostro sito ed è accennata in questa pagina. Tuttavia, la questione merita un proprio spazio qui. La proteinasi K è una proteasi serinica ad ampio spettro appartenente alla famiglia delle subtilisine. È noto nella ricerca per la sua capacità di inattivare le RNasi e le DNasi che danneggerebbero i campioni di acido nucleico desiderati durante l'estrazione. Prende il nome dalla sua capacità originariamente scoperta di idrolizzare la cheratina.

Perché si usa la proteinasi K nell'estrazione del DNA?

La proteinasi K è usata nell'estrazione del DNA per digerire molte proteine contaminanti presenti. Inoltre degrada le nucleasi che possono essere presenti durante l'estrazione del DNA e protegge gli acidi nucleici dall'attacco delle nucleasi.

Quali sono le applicazioni della proteinasi K?

Applicazioni del sequenziamento di prossima generazione (NGS) e delle tecnologie microarray: Purificazione dell'acido nucleico mediante inattivazione delle nucleasi nell'estrazione di DNA e RNA da lisati di lieviti, batteri, cellule di mammiferi e cellule vegetali, miglioramento dell'efficienza del clonaggio di prodotti PCR, Preparazione del campione per la quantificazione dei livelli di addotti al DNA mediante spettrometria di massa con acceleratore, inattivazione di cocktail di enzimi in saggi di protezione con ribonucleasi, aggiunta a procedure di estrazione per ottimizzare la resa di RNA da tumori primari del seno per studi di microarray. Applicazioni di biologia molecolare: rilevamento delle proteine dell'encefalopatia spongiforme bovina che mostrano una resistenza unica alla degradazione proteolitica. Digestione dei tessuti (denaturazione delle proteine) come preparazione alternativa del campione per l'analisi quantitativa mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa in tandem. Modifica specifica delle proteine di superficie cellulare per analizzare le strutture di membrana per la localizzazione delle proteine, generazione di frammenti di proteine per la caratterizzazione di studi funzionali.

Quali sono le linee guida per l'uso della proteinasi K?

Isolamento di DNA ad alto peso molecolare: il DNA cromosomico che è stato incorporato in tappi di agarosio può essere trattato con proteinasi K per inattivare gli enzimi di restrizione usati per digerire il DNA. L'enzima viene utilizzato per questo metodo ad una concentrazione di 1 mg/mL in un tampone contenente 0,5 M EDTA e 1% N-lauroilsarcosina (v/v). Incubare per 24-48 ore a 37 °C. Isolamento del DNA genomico e plasmidico: il DNA genomico o plasmidico può essere purificato da cellule congelate in azoto liquido o da cellule coltivate usando la proteinasi K. Incubare 50-100 mg di tessuto o 1x108 cellule in 1 ml di tampone contenente 0,5% SDS (w/v) con proteinasi K ad una concentrazione di 1 mg/mL a 50 °C per 12-18 ore. Isolamento dell'RNA: Per l'isolamento dell'RNA citoplasmatico, centrifugare il lisato cellulare, rimuovere il surnatante e aggiungere 200 ug/mL di proteinasi K e 2% (w/v) SDS. Incubare per 30 minuti a 37 °C. L'RNA totale può essere isolato separando il lisato prima del trattamento con l'enzima e viene estratto attraverso un ago collegato a una siringa. Inattivazione di RNasi, DNasi ed enzimi nelle reazioni: la proteinasi K è attiva in una varietà di tamponi. L'enzima dovrebbe essere usato in un rapporto di circa 1:50 (w/w, proteinasi K: enzima). Incubare a 37 °C per 30 minuti.

Perché la digestione avviene a 50 °C?

Aumentando la temperatura a 50 °C, alcune proteine vengono dispiegate in modo che possano essere degradate più facilmente dalla proteinasi K. L'enzima è stabile e la sua attività aumenta. L'enzima è stabile e la sua attività aumenta considerevolmente quando vengono aggiunti denaturanti come SDS e urea.

Qual è il modo più veloce ed efficiente per inattivare la proteinasi K?

Come per la maggior parte delle proteine, il modo più efficace per inattivare l'enzima è aumentare la temperatura o cambiare significativamente il pH. La proteinasi K viene inattivata dal calore (ad esempio, incubazione a 55°C). Come si fa a capire se l'enzima funziona? Per determinare se l'enzima funziona, potete eseguire i seguenti 2 passi: Determinare quante micromoli di p-nitroanilide sono prodotte al minuto. Poi dividere per la quantità totale di proteine nella soluzione. In questo modo si può determinare l'attività specifica dell'enzima = unità (un'unità equivale a 1 mole di p-nitroanilide prodotta al minuto), attività specifica = unità di attività enzimatica/mg di proteina totale.

Dove viene scissa la proteinasi K?

La proteinasi K scinde i legami peptidici più il gruppo carbossilico degli amminoacidi idrofobici, alifatici e aromatici sostituiti con N. Scinde anche le ammidi peptidiche.

Qual è la durata della proteinasi K?

La proteinasi K ha una durata di conservazione di 6 mesi se conservata in un luogo asciutto a 4-8 °C, poiché è molto stabile. La conservazione a breve termine a temperatura ambiente non influenzerà l'attività e la stabilità della proteinasi K. Tuttavia, si applicano le condizioni del produttore nei certificati di analisi.

Qual è il ruolo della proteinasi K nel test Covid-19?

La proteinasi K gioca un ruolo importante nella preparazione dei campioni per il test PCR per il Covid-19. La funzione della proteinasi K è la digestione delle proteine nel campione, in particolare delle nucleasi, che altrimenti promuoverebbero la degradazione del DNA e dell'RNA nel campione e quindi falserebbero il risultato finale del test.

Dove si trova la proteinasi in natura?

La proteinasi è stata scoperta per la prima volta nel 1974 negli estratti del fungo Engyodontium album (ex Tritirachium album).

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