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Stickstoff-Bestimmung mittels der Kjeldahl-Methode

Die Kjeldahl-Methode oder der Kjeldahl-Aufschluss wird zur Bestimmung des Stickstoffgehalts in organischen und anorganischen Proben verwendet.

Seit mehr als 100 Jahren wird die Kjeldahl-Methode zur Bestimmung von Stickstoff in einer Vielzahl von Proben eingesetzt. Die Bestimmung des Kjeldahl-Stickstoffs erfolgt seit langem in Lebensmitteln und Getränken, Fleisch, Futtermitteln, Getreide zur Berechnung des Proteingehalts. Außerdem wird die Kjeldahl-Aufschlussmethode für die Stickstoffbestimmung in Abwasser, Böden und anderen Proben verwendet.

Die Kjeldahl-Analyse ist eine offizielle Methode, die in verschiedenen Normen wie AOAC, USEPA, ISO, DIN, Pharmakopöen und verschiedenen europäischen Richtlinien beschrieben ist.

Einige Beispiele für diese offiziellen Verfahren sind:

● Analyse von Milch: Bestimmung des Stickstoffgehalts: EN ISO 8968, AOAC 991.20, Total Nitrogen in Milk; AOAC 991.22 und 991.23, Protein Nitrogen Content of Milk; European Commission Regulation (EC) No 273/2008, Methods for the analysis and quality evaluation of milk and milk products.
● Analyse von Wasser: USEPA-Methode 351.2, Bestimmung von Gesamt-Kjeldahl-Stickstoff in Wasser.
● Analyse von Futtermitteln: Verordnung (EG) Nr. 152/2009 der Europäischen Kommission, Probenahme- und Analysemethoden für die amtliche Kontrolle von Futtermitteln - Bestimmung des Gehalts an Rohprotein.
● Analyse von pharmazeutischen Produkten: Europäisches Arzneibuch (Ph. Eur.), Methode 2.5.9, Pharmacopoeia of the United States (USP), Methode <461>. Stickstoff-Bestimmung.

Das Kjeldahl-Verfahren umfasst drei Hauptschritte:

i) Verdauung - organischer Stickstoff wird in NH₄⁺ umgewandelt
ii) Destillation - NH₄⁺ wird destilliert und in einem Auffanggefäß zurückgehalten
iii) Titration - der Stickstoffgehalt wird bestimmt


Aufschluss
Ziel des Aufschlussverfahrens ist es, alle Stickstoffbindungen in der Probe zu brechen und den gesamten organisch gebundenen Stickstoff in Ammoniumionen (NH₄⁺) umzuwandeln.

Organischer Kohlenstoff wird mit Schwefelsäure unter Bildung von Kohlendioxid und Wasser aufgeschlossen. Bei diesem Prozess verkohlt das organische Material, was durch die Umwandlung der Probe in einen schwarzen Schaum sichtbar gemacht werden kann. Während des Aufschlusses zersetzt sich der Schaum, und schließlich zeigt eine klare Flüssigkeit an, dass die chemische Reaktion abgeschlossen ist.

Zu diesem Zweck wird die Probe bei Temperaturen zwischen 350 und 380 °C mit Schwefelsäure vermischt. Je höher die Temperatur ist, desto schneller kann der Aufschluss erfolgen. Die Geschwindigkeit des Aufschlusses kann durch die Zugabe von Salzen und Katalysatoren erheblich verbessert werden. Natrium- und/oder Kaliumsulfat werden zugesetzt, um den Siedepunkt der Schwefelsäure zu erhöhen, und Katalysatoren werden zugesetzt, um die Geschwindigkeit und Effizienz des Aufschlussverfahrens zu steigern. Oxidationsmittel wie Wasserstoffperoxid können ebenfalls zugesetzt werden, um die Geschwindigkeit noch weiter zu erhöhen.

Die Aufschlusszeit hängt von der chemischen Struktur der Probe, der Temperatur, den Mengen an Sulfatsalz und dem Katalysator ab.

CHNO + H₂SO₄ --> (NH₄)₂SO₄ + H₂O

Anmerkungen: katalytische Reaktion; organische Verbindungen: Proteine, Aminosäuren, Peptide, Amine, Amide, ...)

Nach Abschluss des Aufschlusses lässt man die Probe auf Raumtemperatur abkühlen, verdünnt sie mit Wasser und überführt sie in die Destillationseinheit.

Bei allgemeinen Lebensmittel- und Futtermittelanwendungen wird Schwefelsäure 98% für Aufschlüsse verwendet. Um die Geschwindigkeit weiter zu erhöhen, können auch Oxidationsmittel zugesetzt werden. Wasserstoffperoxid wird am häufigsten verwendet, da es die Zersetzung von organischem Material beschleunigt und eine schaumhemmende Wirkung hat, um die Schaumbildung während des Aufschlusses zu kontrollieren, was besonders vorteilhaft ist, wenn die Probe Fett oder Kohlenhydrate enthält.

Die Verwendung von Wasserstoffperoxid, das in Gegenwart von Schwefelsäure sehr reaktiv ist, kann jedoch zum Verlust von Stickstoff als N₂-Gas führen. Daher wird Wasserstoffperoxid nur dann empfohlen, wenn sich die Aufschlusszeit spürbar verkürzt, und es sollte der Probe schrittweise zugesetzt werden. Wenn die Schaumbildung das einzige Problem darstellt, ist es besser, 1-3 Tropfen einer speziellen Antischaumemulsion zu verwenden. Nach dem Aufschluss und vor der Neutralisierung der Schwefelsäure durch Zugabe von konzentriertem Natriumhydroxid lässt man die Probe auf Raumtemperatur abkühlen und verdünnt sie mit destilliertem Wasser. Dies geschieht, um ein Verspritzen der Probe aufgrund des Siedens zu vermeiden, das durch die Reaktionswärme entsteht, die beim Mischen der konzentrierten Säure und der Base freigesetzt wird. Wenn die Proben unmittelbar nach dem Abkühlen mit 10-20 mL Wasser verdünnt werden, kann außerdem eine Kristallisation vermieden werden.

Probenvorbereitung
Die Probe muss homogen sein, da das tatsächliche Gewicht der zu verwendenden Probe sowohl vom Stickstoffgehalt als auch von der Homogenität abhängt. Während des Aufschlusses werden die organischen Substanzen durch die Schwefelsäure zerstört. Kjeldahl-Katalysatoren in Tablettenform erhöhen den Siedepunkt der Mischung und beschleunigen den Prozess. Das tatsächliche Gewicht der Probe hängt ab von:

● dem Stickstoffgehalt: je höher der N-Gehalt, desto geringer das Gewicht.
● Homogenität der Probe: Wenn die Probe nicht homogen ist, können Sie die Auswirkungen durch Erhöhung des Gewichts verringern. Weniger als 1 g bei einer homogenen Probe. Größere Einwaage > 2 g bei inhomogenen Proben.
● Die Konzentration des Titriermittels: Der Verbrauch an Titriermittel sollte ungefähr zwischen 5-15 mL liegen.

Dann müssen der Probe Chemikalien zugesetzt werden: Schwefelsäure und Katalysatoren.

Die Menge der zu verwendenden Schwefelsäure ergibt sich aus:

● Umwandlung in K₂SO₄ (K₂SO₄ ist ein Bestandteil der Tabletten)
● Verbrauch von Schwefelsäure durch organische Stoffe
● Verluste durch die Verdampfung während des Kochens (1 mL pro Kochstunde)
● Verbleibendes Volumen unter Berücksichtigung des Volumens der Tabletten und der verwendeten Schwefelsäure

Der Einsatz der Katalysatoren dient der Reaktionsbeschleunigung durch Erhöhung des Siedepunkts des Gemischs und einem Metallkatalysatoreffekt.

Kjeldahl-Katalysatoren
Bei den Kjeldahl-Katalysatoren handelt es sich in der Regel um Tabletten oder Pulver, die zu mehr als 97% aus einem Salz bestehen, das die Siedetemperatur der Schwefelsäure erhöht, und zu 1 bis 3 % aus einer Art von Katalysator oder einem Katalysatorgemisch, um die Geschwindigkeit und Effizienz des Aufschlussverfahrens zu erhöhen. Typische Katalysatoren sind Selen oder Metallsalze von Kupfer oder Titan. Die Auswahl eines bestimmten Katalysators hängt von ökologischen und toxischen Aspekten oder eher praktischen Gründen wie der Reaktionszeit oder der Schaumbildung und Zerstäubung ab. Der selenhaltige Wieninger-Katalysator reagiert beispielsweise am schnellsten, ist aber giftig, während ein kupferhaltiger Katalysator wie Missouri sowohl für den Menschen als auch für die Umwelt wesentlich unbedenklicher ist, aber einen langsameren Verdauungsprozess ermöglicht. Ein idealer Kompromiss ist der Mischkatalysator, der aus Kupfer- und Titansulfat besteht.

Die Wahl des Katalysators hängt von mehreren Faktoren ab, wie z.B.:

● Zeit, die für den Aufschluss benötigt wird
● Ökologische Überlegungen
● Sicherheitsüberlegungen
● Schaumbildung auf der Probe

Typische Bedingungen für Proben, die keine spezifischen Bedingungen benötigen, sind ein Siedepunkt von 370 ºC, keine Stickstoffverluste und minimaler Zeitbedarf. Dies wird mit 2 mL Schwefelsäure und 1 g Katalysator erreicht.

Tipps für den Aufschluss
● Optimale Bedingungen sind erreicht, wenn die Kondensationszone 5 cm unterhalb der Verengung des Probenglases bleibt.
● Bei schäumenden Proben kann "Antifoam" oder Stearinsäure verwendet werden.
● Zur Verkürzung der Aufschlusszeit kann H₂O₂ zugesetzt werden.
● Minimaler Einsatz von Chemikalien, wenn möglich mit Mikro-Kjeldahl.
● Bei flüssigen Proben verhindern Siedestäbe Siedeverzüge.
● Langsame Erhöhung der Aufschlusstemperatur reduziert die Schaumbildung bei problematischen Proben.

Aufschluss-Übersicht

Destillation
Im Allgemeinen wird die saure Probe mit Wasser verdünnt und mit konzentrierter Natriumhydroxidlösung neutralisiert. Während des Destillationsschritts werden die Ammoniumionen (NH₄⁺) durch Zugabe von Alkali (NaOH) in Ammoniak (NH₃) umgewandelt. Das Ammoniak (NH₃) wird durch Wasserdampfdestillation in den Sammelbehälter überführt. Der Aufnahmebehälter für das Destillat wird mit einer Absorptionslösung gefüllt, um das gelöste Ammoniakgas aufzufangen. Gängige Absorptionslösungen sind wässrige Borsäure [B(OH)₃] mit einer Konzentration von 2-4 %. Andere Säuren, die genau dosiert werden, wie Schwefelsäure oder Salzsäure, können ebenfalls verwendet werden, um Ammoniak in Form von solvatisierten Ammoniumionen abzufangen.

(NH₄)₂SO₄ + 2 NaOH --> 2 NH₃ (gas) + Na₂SO₄ + 2 H₂O

Verfahren
● Verdünnung der sauren Aufschlussmischung durch Zugabe von Wasser
● Alkalisierung zur Umwandlung von NH₄⁺ in NH₃ durch Zugabe von Natriumhydroxid
● Wasserdampfdestillation zur Extraktion des NH₃ aus dem Gefäß durch Zugabe von Wasserdampf
● Auffangen des Ammoniaks in einer sauren Auffanglösung. Dieser Schritt kann variiert werden, da er zu einer Borsäure-Direkttitration oder einer Rücktitration führen kann.

○ Schritte im Falle der Borsäuretitration:

- Verdünnung mit Wasser, in der Regel 4 mL pro mL Schwefelsäure, 2,5 mL bei Verwendung eines automatischen Probenehmers. Dies verhindert heftige Reaktionen.
- Alkalisierung mit Natriumhydroxid 32%. 4,5 mL pro mL verwendeter Schwefelsäure, wobei NH₄⁺ in NH₃ umgewandelt wird.
- Vorbereitung des Empfängers: Verwendung von 2%iger Borsäure mit KCl für niedrige N-Gehalte, 0,02 -6,75 mg/Probenröhrchen. Verwenden Sie Borsäure 4%.

○ Schritte im Falle einer Rücktitration:

- Verdünnung mit Wasser, in der Regel 4 mL pro mL verwendeter Schwefelsäure, 2,5 mL, wenn ein Autosampler angeschlossen ist. Dies verhindert heftige Reaktionen.
- Alkalisierung mit Natriumhydroxid 32%, 4,5 mL pro mL verwendeter Schwefelsäure, wodurch NH₄⁺ in NH₃ umgewandelt wird.
- Vorbereitung des Empfängers: Verwendung von Schwefelsäure 0,25 ml/L. Das Volumen muss genau dosiert werden und beträgt normalerweise 20 mL.
- Destillation mit Wasserdampf zwischen 180-300 s zur Abtrennung von NH₃
- Sammeln Sie die Probe in Schwefelsäure mit Ammoniak. Der Auslassschlauch des Kondensators und die Elektrode müssen vollständig eingetaucht werden.

Hinweise zur Destillation
● Nach dem Aufschluss müssen die Proben auf 50 bis 100 °C abkühlen, bevor sie weiterverarbeitet werden können.
● Die optimale Natriumhydroxidkonzentration beträgt 32%.
● Bei sehr niedrigen N-Gehalten sollte 2%ige Borsäure mit Kaliumchlorid (3 g/L) als Vorlauflösung gewählt werden, um niedrigere Nachweisgrenzen zu erreichen.

Überblick über die Destillation

Titration
Die Konzentration der aufgefangenen Ammoniumionen kann durch zwei Arten von Titrationen bestimmt werden:

1. Bei Verwendung der Borsäurelösung als Aufnahmelösung wird eine Säure-Base-Titration mit Standardlösungen von Schwefelsäure oder Salzsäure und einer Mischung von Indikatoren durchgeführt. Je nach der Menge der vorhandenen Ammoniumionen werden Konzentrationen im Bereich von 0,01 mol/L bis 0,5 mol/L verwendet. Der Nachweis des Endpunkts kann manuell mit einer kolorimetrischen Titration unter Verwendung einer Indikatorenkombination erfolgen. Die Kombination von Methylrot- und Methylenblau-Indikatoren wird bei vielen Methoden häufig verwendet. Alternativ kann der Endpunkt auch potentiometrisch mit einer pH-Elektrode bestimmt werden. Diese Titration wird als direkte Titration bezeichnet:

B(OH)₄^- + HX ↔ X^- + B(OH)₃ + H₂O
HX= starke Säure (X=Cl^-, etc.)

2. Bei der Verwendung von Schwefelsäure-Standardlösung als Absorptionslösung wird die restliche Schwefelsäure (der nicht mit NH₃ umgesetzte Überschuss) mit Natriumhydroxid-Standardlösung titriert und aus der Differenz die Ammoniakmenge berechnet. Der Endpunkt wird mit einem Farbindikator nachgewiesen. Methylrot ist normalerweise der bevorzugte Indikator. Diese Titration wird als Rücktitration bezeichnet:

H₂SO₄ (Restbetrag) + 2NaOH --> SO₄^2- + 2Na⁺ + 2H₂O

Tipps zur Titration
● Je nach Vorschrift oder Methode kann entweder die potentiometrische oder die kolorimetrische Titration gewählt werden.
● Bei der Endpunkt- und kolorimetrischen Titration muss der pH-Wert der Borsäure auf 4,65 eingestellt werden.
● Die Rücktitration kann verwendet werden, wenn Borsäure vermieden werden soll (nur bei potentiometrischer Titration).
● Bei bekannten Proben kann ein Startvolumen für die Titration verwendet werden, um den Titrationsschritt zu beschleunigen. (Nur sinnvoll bei hohen Titrationsvolumina)
● Der Destillations- und Titrationsprozess kann mittels Online-Titration synchronisiert werden.

Überblick über die Titration

Berechnungen
Bei den Berechnungen des Stickstoff- oder Eiweißanteils ist zu berücksichtigen, welche Art von Auffanglösung verwendet wurde und welche Verdünnungsfaktoren bei der Destillation zum Einsatz kamen. In den nachstehenden Gleichungen steht "N" für Normalität. "mL Blank" bezieht sich auf die Milliliter Base, die zur Rücktitration eines Reagenzienblindwertes benötigt werden, wenn Standardsäure die Vorlagelösung ist, oder bezieht sich auf Milliliter Standardsäure, die zur Titration eines Reagenzienblindwertes benötigt werden, wenn Borsäure die Vorlagelösung ist.

● Bei Verwendung von Borsäure als Aufnahmelösung lautet die Gleichung:

% Stickstoff = (mL Standardsäure - mL Blindprobe) x N der Säure x 1,4007 / Gewicht der Probe (g)

● Bei Verwendung von Standardsäure als Aufnahmelösung lautet die Gleichung:

% Stickstoff = ((mL Standardsäure x N der Säure) - (mL Leerwert x N der Base)) - (mL Standardbase x N der Base) x 1,4007 / Gewicht der Probe (g)

Wenn anstelle von % Stickstoff % Protein bestimmt werden soll, wird der berechnete % N mit einem Faktor multipliziert, der von der Art des in der Probe vorhandenen Proteins abhängt. Einige Beispiele finden Sie in der folgenden Tabelle*:

*Quelle: Angepasst und verändert von Merrill und Watt (1973)

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