Imidazol für Pufferlösungen

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Die hohe Affinität von Nickel-Ionen zu Histidin hat sich als sehr vorteilhaft für die Aufreinigung rekombinanter Proteine erwiesen, die mit einem sogenannten 'His-tag' (in der Regel 6 Histidinreste am N- oder C-Terminus des aufzureinigenden Proteins) versehen wurden. Das auf diese Weise modifizierte Protein kann nach Expression in Vaccinia-infizierten Zellen (3), Bakterien (4), Hefe oder Insektenzellen einfach mittels Nickel-NTA-Säulen aufgereinigt werden. Das an das Säulenmaterial gebundene Protein wird mit Imidazol, das mit den Histidinresten um die Nickelionen kompetiert, eluiert. Die Imidazol-Konzentration hängt von dem jeweiligen 'His-tag'-Protein ab und liegt häufig zwischen 40-200 mM Imidazol.Imidazol wird auch häufig als Puffersubstanz für enzymatische Reaktionen verwendet. Die Arbeitskonzentration liegt häufig zwischen 20 mM (2) und 50 mM (5), kann aber auch bis 100 mM (6) reichen. Eine Konzentration von 1 M reduziert die Schmelztemperatur von DNA um ca. 13°C und verändert das Mobilitätsverhalten in der Gelelektrophorese (7).Achtung: DEPC reagiert mit der nicht-protonierten Form von Imidazol (1). Es entsteht N-Carbethoxyimidazol. DEPC hydrolysiert und es ist daher unter Umständen notwendig die exakte Konzentration zu bestimmen. Die aktuelle DEPC-Konzentration kann durch Inkubation mit 10 mM Imidazol (pH 7,5) spektrophotometrisch bei 230 nm quantitativ bestimmt werden.Stabilität: Lösungen von Imidazol sind mehrere Jahre haltbar und müssen nicht autoklaviert und nicht lichtgeschützt gelagert werden. Sie verfärben sich mit der Zeit gelblich. Diese Lösungen sind auch nach langer Lagerung noch für die Elution von His-tag-Proteinen geeignet.

Literature

(1) Miles, E.W. (1977) Methods Enzymol. 47, 431-442. Eigenschaften von DEPC bei seiner Verwendung als RNase-Inhibitor. (2) Storrie, B. & Madden, E.A. (1990) Methods Enzymol. 182, 203-225. Isolierung subzellulärer Organellen: Bestimmung der Aktivität von 'Marker'-Enzymen. (3) Janknecht, R. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8972-8976. Schnelle, effiziente Reinigung von nativem 'His-tag' Protein aus Vaccinia-Virus infizierten Zellen. (4) Ohkuma, Y. et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 4856-4866. Aufreinigung von humanem rekombinantem 6His-TFIIE-α nach Überexpression in E. coli. (5) Marrakchi, N. et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1244, 147-156. Aktivitätsbestimmung der Fibrinogenase-Aktivität von Cerastocytin. (6) Tavenier, M. et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1244, 351-356. Untersuchung des Adenylat-Stoffwechsels in menschlichem und Ratten-Myocardium. (7) Eli, P. et al. (1999) J. Biochem. 125, 790-794. DNA-Denaturierung mit Imidazol.