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Determinazione dell'azoto con il metodo Kjeldahl

Il metodo Kjeldahl o digestione Kjeldahl è usato per determinare il contenuto di azoto in campioni organici e inorganici.

Per più di 100 anni il metodo Kjeldahl è stato utilizzato per la determinazione dell'azoto in una vasta gamma di campioni. La determinazione dell'azoto Kjeldahl viene fatta in alimenti e bevande, carne, mangimi, cereali e foraggi per il calcolo del contenuto proteico. Inoltre, il metodo di digestione Kjeldahl è usato per la determinazione dell'azoto nelle acque reflue, nei suoli e in altri campioni.

È un metodo ufficiale, ed è descritto in diversi standard come AOAC, USEPA, ISO, DIN, Farmacopee, e diverse direttive europee.

Alcuni esempi di queste procedure ufficiali sono:

● Analisi del latte: determinazione del contenuto di azoto: EN ISO 8968, AOAC 991.20, Total Nitrogen in Milk; AOAC 991.22 e 991.23, Protein Nitrogen Content of Milk; European Commission Regulation (EC) No 273/2008, Methods for the analysis and quality evaluation of milk and milk products.
● Analisi dell'acqua: USEPA Method 351.2, Determinazione dell'azoto totale Kjeldahl nell'acqua.
● Analisi dei mangimi: Regolamento (CE) n. 152/2009 della Commissione Europea, Metodi di campionamento e analisi per il controllo ufficiale degli alimenti per animali - Determinazione del contenuto di proteina grezza.
● Analisi dei prodotti farmaceutici: Farmacopea Europea (Ph. Eur.) metodo 2.5.9., Farmacopea degli Stati Uniti (USP), metodo <461>.

Determinazione dell'azoto.La procedura Kjeldahl comporta tre fasi principali:

i) Digestione - l'azoto organico è convertito in NH₄⁺.
ii) Distillazione - NH₄⁺ viene distillato e trattenuto in un recipiente ricevitore.
iii) Titolazione - viene determinato il contenuto di azoto.

Digestione
Lo scopo della procedura di digestione è quello di rompere tutti i legami azotati nel campione e convertire tutto l'azoto organicamente legato in ioni ammonio (NH₄⁺).

Il carbonio organico digerito con l'acido solforico forma anidride carbonica e acqua. In questo processo il materiale organico si carbonizza e ciò può essere visualizzato dalla trasformazione del campione in schiuma nera. Durante la digestione, la schiuma si decompone e infine un liquido chiaro indica il completamento della reazione chimica.

A questo scopo, il campione viene mescolato con acido solforico a temperature comprese tra 350 e 380 °C. Più alta è la temperatura utilizzata, più velocemente si può ottenere la digestione. La velocità della digestione può essere ampiamente migliorata dall'aggiunta di sali e catalizzatori. Il solfato di sodio e/o di potassio viene aggiunto per aumentare il punto di ebollizione dell'acido solforico e i catalizzatori vengono aggiunti per aumentare la velocità e l'efficienza della procedura di digestione. Gli agenti ossidanti come il perossido di idrogeno possono anche essere aggiunti per migliorare ulteriormente la velocità.

Il tempo di digestione dipende dalla struttura chimica del campione, dalla temperatura, dalle quantità di sale solfato e dal catalizzatore:

CHNO + H₂SO₄ --> (NH₄)₂SO₄ + H₂O

Commenti: reazione catalitica; composti organici: proteine, aminoacidi, peptidi, ammine, ammidi, ...

Al termine della digestione, il campione viene lasciato raffreddare a temperatura ambiente, quindi diluito con acqua e trasferito all'unità di distillazione.

Nelle applicazioni generali per alimenti e mangimi, si usa l'acido solforico al 98% per le digestioni. Gli agenti ossidanti possono anche essere aggiunti per migliorare ulteriormente la velocità. Il perossido di idrogeno è il più usato, poiché accelera la decomposizione del materiale organico e ha un'azione antischiuma per controllare la schiuma durante la digestione, particolarmente vantaggiosa quando il campione contiene grassi o carboidrati. Tuttavia, l'uso del perossido di idrogeno, che è altamente reattivo in presenza di acido solforico, può causare la perdita di azoto come gas N2. Pertanto, il perossido di idrogeno è raccomandato solo quando c'è un miglioramento apprezzabile del tempo di digestione, e dovrebbe essere aggiunto al campione gradualmente. Se la formazione di schiuma è l'unica sfida, è meglio usare 1-3 gocce di un'emulsione antischiuma brevettata. Dopo la digestione e prima della neutralizzazione dell'acido solforico con l'aggiunta di idrossido di sodio concentrato, il campione viene lasciato raffreddare a temperatura ambiente e diluito con acqua distillata. Questo viene fatto per evitare spruzzi del campione a causa dell'ebollizione indotta dal calore di reazione dissipato quando l'acido concentrato e la base sono mescolati. Inoltre, se i campioni vengono diluiti con 10-20 mL di acqua subito dopo il raffreddamento, la cristallizzazione può essere evitata.

Preparazione del campione
Preparazione del campione: il campione deve essere omogeneo poiché il peso effettivo del campione da utilizzare dipende dal contenuto di azoto e dall'omogeneità. Durante la digestione le sostanze organiche vengono distrutte dall'acido solforico. I catalizzatori Kjeldahl in compresse aumentano il punto di ebollizione della miscela e rendono il processo più veloce. Il peso effettivo del campione dipende da:

● Il contenuto di azoto: per un maggiore contenuto di N, un peso inferiore.
● L'omogeneità del campione: se il campione non è omogeneo si può ridurre l'impatto di questo aumentando il peso. Meno di 1 g per un campione omogeneo. Peso maggiore > 2 g per campioni non omogenei.
● La concentrazione del titolante: il consumo di titolante dovrebbe essere approssimativamente tra 5-15 mL .

Poi, le sostanze chimiche devono essere aggiunte al campione: acido solforico e catalizzatori.

La quantità di acido solforico da utilizzare è data da:

● Conversione in K₂SO₄ (K₂SO₄ è un componente delle pastiglie).
● Consumo di acido solforico da parte della materia organica.
● Perdite originate dall'evaporazione durante l'ebollizione (1 mL per ora di ebollizione).
● Volume rimanente considerando il volume delle pastiglie e l'acido solforico utilizzato.L'uso dei catalizzatori è per l'accelerazione della reazione aumentando il punto di ebollizione della miscela e un effetto di catalisi del metallo.

Catalizzatori Kjeldahl
I catalizzatori Kjeldahl sono tipicamente compresse o polvere composte da più del 97% di un sale che aumenta la temperatura di ebollizione dell'acido solforico e 1-3% di un tipo di catalizzatore o una miscela di catalizzatori per aumentare la velocità e l'efficienza della procedura di digestione. I catalizzatori tipici sono selenio o sali metallici di rame o titanio. La scelta di un particolare catalizzatore dipende da aspetti ecologici e tossici o da ragioni più pratiche come il tempo di reazione o la formazione di schiuma e lo sputtering. Per esempio, il catalizzatore Wieninger contenente selenio reagisce più velocemente ma è tossico mentre un catalizzatore contenente rame come Missouri è considerevolmente più sicuro sia per l'uomo che per l'ambiente ma dà un processo di digestione più lento. Un compromesso ideale è il catalizzatore misto composto da solfato di rame e titanio.

La selezione del catalizzatore dipende da diversi fattori come:

● Tempo necessario per la digestione.
● Considerazioni ecologiche.
● Considerazioni sulla sicurezza.
● Se c'è formazione di schiuma sul campione.

Le condizioni tipiche per i campioni che non hanno bisogno di condizioni specifiche sono un punto di ebollizione di 370 ºC, nessuna perdita di azoto e tempo minimo necessario. Questo si ottiene usando 2 mL di acido solforico più 1 g di catalizzatore.

Suggerimenti per la digestione:
● Le condizioni ottimali si ottengono quando la zona di condensazione rimane 5 cm sotto la costrizione del tubo del campione.
● Per campioni schiumosi si può usare "Antifoam" o acido stearico.
● Per ridurre il tempo di digestione si può aggiungere H₂O₂.
● Uso minimo di prodotti chimici usando micro-Kjeldahl quando possibile.
● Per i campioni liquidi, le barre di ebollizione prevengono i ritardi di ebollizione.
● Aumentare lentamente la temperatura di digestione riduce la formazione di schiuma dei campioni problematici.

Panoramica sulla digestione

Distillazione
In generale, il campione acido viene diluito con acqua e neutralizzato con una soluzione concentrata di idrossido di sodio. Durante la fase di distillazione gli ioni di ammonio (NH₄⁺) vengono convertiti in ammoniaca (NH₃) aggiungendo alcali (NaOH). L'ammoniaca (NH₃) viene trasferita nel recipiente ricevente per mezzo della distillazione a vapore. Il recipiente di ricezione del distillato è riempito con una soluzione assorbente per catturare il gas di ammoniaca dissolto. Le soluzioni assorbenti comuni comprendono acido borico acquoso [B(OH)₃] con una concentrazione del 2-4%. Altri acidi, dosati con precisione, come l'acido solforico o l'acido cloridrico, possono anche essere usati per catturare l'ammoniaca, sotto forma di ioni di ammonio solvatati.

(NH₄)₂SO₄ + 2 NaOH --> 2 NH₃ (gas) + Na₂SO₄ + 2 H₂O

Procedura
● Diluizione della miscela di digestione acida con aggiunta di acqua.
● Alcalinizzazione per convertire NH₄⁺ in NH₃ con aggiunta di idrossido di sodio.
● Distillazione a vapore per estrarre l'NH₃ dal recipiente con aggiunta di vapore acqueo.
● Raccolta dell'ammoniaca in una soluzione acida del ricevitore. Questa fase può essere variata in quanto porterà a una titolazione diretta con acido borico o a una titolazione posteriore.
○ Fasi in caso di titolazione dell'acido borico:

- Diluizione con acqua, tipicamente 4 mL per mL usato di acido solforico, 2,5 mL quando si usa un campionatore automatico. Questo previene reazioni violente
- Alcalinizzazione con idrossido di sodio 32%. 4,5 mL per mL usato di acido solforico, convertendo NH₄⁺ in NH₃.
- Preparazione del ricevitore: usare acido borico al 2% con KCl per un basso contenuto di N, 0,02 -6,75 mg/provetta campione. Utilizzare acido borico al 4%.

○ Fasi in caso di retrotitolazione:
- Diluizione con acqua, tipicamente 4 mL per mL di acido solforico utilizzato, 2,5 mL nel caso in cui sia collegato un autocampionatore. Questo previene reazioni violente.
- Alcalinizzazione con idrossido di sodio 32%, 4,5 mL per mL di acido solforico utilizzato, convertendo NH₄⁺ in NH₃.
- Preparazione del ricevitore: utilizzare acido solforico 0,25 ml/L. Il volume deve essere dosato con precisione e sarà di solito 20 mL.
- Distillazione con vapore acqueo tra 180-300 s per separare NH₃.
- Raccogliere il campione in acido solforico con ammoniaca. Il tubo di uscita del condensatore e l'elettrodo devono essere completamente immersi.

Suggerimenti per la distillazione
● Dopo la digestione i campioni devono essere raffreddati a 50-100 °C prima di poter essere ulteriormente elaborati.
● La concentrazione ottimale di idrossido di sodio è del 32%.
● Per contenuti di N molto bassi, il 2% di acido borico con cloruro di potassio (3 g/L). Dovrebbe essere scelto come soluzione ricevente per ottenere limiti di rilevamento più bassi.

Panoramica sulla distillazione

Titolazione
La concentrazione degli ioni di ammonio catturati può essere determinata utilizzando due tipi di titolazioni:

1. Quando si utilizza la soluzione di acido borico come soluzione assorbente, viene eseguita una titolazione acido-base utilizzando soluzioni standard di acido solforico o acido cloridrico e una miscela di indicatori. A seconda della quantità di ioni ammonio presenti, si utilizzano concentrazioni comprese tra 0,01 mol/L e 0,5 mol/L. La rilevazione del punto finale può essere effettuata manualmente, con una titolazione colorimetrica, utilizzando una combinazione di indicatori. La combinazione di indicatori rosso metile e blu di metilene è frequentemente utilizzata in molti metodi. In alternativa, il punto finale può essere determinato potenziometricamente con un elettrodo pH. Questa titolazione è chiamata titolazione diretta:

B(OH)₄^- + HX ↔ X^- + B(OH)₃ + H₂O

HX= strong acid (X=Cl-, etc.)

2. Quando si usa la soluzione standard di acido solforico come soluzione assorbente, l'acido solforico residuo (l'eccesso non reagito con NH₃) viene titolato con la soluzione standard di idrossido di sodio e per differenza si calcola la quantità di ammoniaca. Il punto finale viene rilevato utilizzando un indicatore di colore. Il rosso metile è solitamente l'indicatore preferito. Questa titolazione è chiamata titolazione posteriore:

H₂SO₄ (Residual) + 2NaOH --> SO₄^2- + 2Na⁺ + 2H₂O

Suggerimenti per la titolazione
● A seconda della regolazione o del metodo, si può scegliere la titolazione potenziometrica o colorimetrica.
● Per la titolazione potenziometrica e colorimetrica, il pH dell'acido borico deve essere regolato a 4,65.
● La titolazione a ritroso può essere usata quando l'acido borico deve essere evitato (solo per la titolazione potenziometrica).
● Per campioni molto noti si può usare un volume iniziale di titolazione per accelerare la fase di titolazione. (Utile solo per alti volumi di titolazione).
● Il processo di distillazione e di titolazione può essere sincronizzato, per mezzo della titolazione online.

Panoramica sulla titolazione

Calcoli
I calcoli per la % di azoto o la % di proteine devono tenere conto di quale tipo di soluzione ricevente è stata usata e di qualsiasi fattore di diluizione usato durante il processo di distillazione. Nelle equazioni seguenti, "N" rappresenta la normalità. "mL di bianco" si riferisce ai millilitri di base necessari per titolare un reagente bianco se la soluzione ricevente è l'acido standard o si riferisce ai millilitri di acido standard necessari per titolare un reagente bianco se la soluzione ricevente è l'acido borico.

● Quando l'acido borico è usato come soluzione ricevente, l'equazione è:

% Azoto = (mL di acido standard - mL di bianco) x N di acido x 1.4007 / Peso del campione (g)

● Quando l'acido standard è usato come soluzione ricevente, l'equazione è:

% Azoto = ((mL acido standard x N di acido) - (mL bianco x N di base)) - (mL base standard x N di base) x 1,4007 / Peso del campione (g)

Se si desidera determinare la % di proteine invece della % di azoto, la % N calcolata viene moltiplicata per un fattore che dipende dal tipo di proteine presenti nel campione. Possiamo trovare alcuni esempi nella seguente tabella*:

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