Comments
La ribonucleasa A (RNasa A) es una endorribonucleasa que escinde específicamente el ARN monocatenario en el extremo 3' de los residuos de pirimidina (citosina, uracilo). Esto da lugar a pirimidina 3'-fosfatos u oligonucleótidos con pirimidina 3'-fosfatos terminales. El pH óptimo está en el rango de 7,0 - 7,5. La RNasa A se utiliza para la purificación de ADN libre de ARN, para la eliminación de regiones no hibridadas de los híbridos ARN-ADN o como marcador de peso molecular. La enzima es inhibida por el pirocarbonato de dietilo (DEPC), la sal de guanidinio (4 M GuaSCN), el β-mercaptoetanol, los metales pesados, los complejos de vanadilribonucleósidos, el inhibidor de la RNasa de la placenta humana y por el ADN de manera competitiva. Con respecto a esto último, el ADN desnaturalizado es más eficaz que los ácidos nucleicos nativos. Sin embargo, la RNasa A es muy activa en diversas condiciones y es difícil de inactivar. A bajas concentraciones de sal (hasta 100 mM de NaCl), la RNasa A escinde el ARN de cadena simple y doble y el ARN en híbridos de ARN-ADN. A altas concentraciones de sal (>300 mM de NaCl), solo se escinde el ARN monocatenario. Para eliminar la enzima de las muestras, hay que digerirla con proteinasa K. Normalmente se añade SDS como soporte (concentración final del 0,6%). Posteriormente, son necesarias algunas extracciones de fenol. Aplicaciones: Manipulaciones enzimáticas de ADN y ARN: Ref. 1 Suppl. 8 página 3.13.1; minipreparaciones de ADN de plásmidos: Ref. 1 Suppl. 24 página 1.6.6; hibridación in situ de ARN celular: Ref. 1 Suppl. 7 página 14.3.8; extracción de ARN de preparaciones de plásmidos: Ref. 2 pág. 1.51. Las soluciones madre se preparan en concentraciones de 1 - 10 mg/ml en 10 mM Tris - HCl, pH 7.5; 15 mM NaCl o en 10 mM Tris - HCl, pH 7.5; 1 mM EDTA, pH 8.0 (tampón TE). La concentración de trabajo recomendada es de 10 μg/ml (eliminación del ARN de las preparaciones de plásmidos; 1 hora, RT) o 100 ng/ml (preparación del extremo romo o "blunt end" del ADNc de doble cadena). Definición de la unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima que provoca la hidrólisis del ARN con una constante de velocidad, k = 1, a 25°C y pH 5,0 (unidad Kunitz). Eliminación de la actividad de la DNasa: Dado que la RNasa A es estable al calor, la actividad de las DNasas que son lábiles al calor puede ser destruida por ebullición. La RNasa A puede disolverse a una concentración de 10 mg/ml en acetato de sodio 0,01 M (pH 5,2). Calentar a 100°C en un baño de agua durante 15 minutos. Apagar el baño de agua para permitir que la RNasa A se enfríe lentamente hasta alcanzar la temperatura ambiente. Ajustar el pH añadiendo 0,1 veces el volumen de Tris-Cl 1 M (pH 7,4). Después de la alícuota, el producto se almacena a -20°C. Precaución: ¡La RNasa precipita cuando las soluciones concentradas se calientan a 100°C a pH neutro! Además, a la hora de inactivar por calor las DNasas en soluciones de RNasa A, siempre hay que tener en cuenta que el procedimiento descrito en la literatura puede no tener el éxito deseado y más bien conlleva el riesgo de que la RNasa A precipite y pierda así parte de su actividad. Por ello, para aplicaciones que requieran una ausencia absoluta de DNasa, recomendamos nuestro producto A3832, RNasa A (libre de DNasa). Estabilidad: La RNasa A se agrega durante la liofilización y el almacenamiento. La enzima tiene una gran afinidad por el vidrio, lo que debe tenerse en cuenta. A pH neutro (por ejemplo, en PBS pH 7,4) y a altas concentraciones (> 10 mg/ml) la enzima precipita. A +4°C (liofilizado y almacenado en seco) es estable durante varios años, en solución (-20°C) también durante varios años y a (+4°C) durante varias semanas.
Literature
(1) Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (1995) Current Protocols in Molecular Biology. Página 3.13.1 Suppl. 8; Greene Publishing & Wiley-Interscience, Nueva York (2) Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition Page A4.39. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. (3) Melton, D.A. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 7035-7056. Síntesis eficiente in vitro de muestras de ARN biológicamente activo y de hibridación de ARN a partir de plásmidos que contienen el promotor SP6. (4) Winter, E. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7575-7579. Un método para detectar y caracterizar mutaciones puntuales en genes transcritos.
