Productos Destacados

Determinación del nitrógeno mediante el método Kjeldahl

El método Kjeldahl o digestión Kjeldahl se utiliza para determinar el contenido de nitrógeno en muestras orgánicas e inorgánicas.
Desde hace más de 100 años, el método Kjeldahl se utiliza para la determinación del nitrógeno en una amplia gama de muestras. La determinación del nitrógeno Kjeldahl se realiza en alimentos y bebidas, carne, piensos, cereales y forrajes para el cálculo del contenido en proteínas. Asimismo, el método de digestión Kjeldahl se utiliza para la determinación del nitrógeno en aguas residuales, suelos y otras muestras.
Es un método oficial, y está descrito en diferentes normas como la AOAC, la USEPA, la ISO, la DIN, las farmacopeas y diferentes directivas europeas.

Algunos ejemplos de estos procedimientos oficiales son:

● Análisis de la leche: Determinación del contenido de nitrógeno: EN ISO 8968, AOAC 991.20, Nitrógeno total en la leche; AOAC 991.22 y 991.23, Contenido de nitrógeno proteico en la leche; Reglamento (CE) nº 273/2008 de la Comisión Europea, Métodos de análisis y evaluación de la calidad de la leche y los productos lácteos.
● Análisis del agua: Método USEPA 351.2, Determinación del nitrógeno total Kjeldahl en el agua.
● Análisis de piensos: Reglamento (CE) nº 152/2009 de la Comisión Europea, Métodos de muestreo y análisis para el control oficial de los piensos - Determinación del contenido de proteína bruta.
● Análisis de productos farmacéuticos: Farmacopea Europea (Ph. Eur.) método 2.5.9., Farmacopea de los Estados Unidos (USP), método <461>. Determinación del nitrógeno.

El procedimiento Kjeldahl implica tres pasos principales:

i) Digestión: el nitrógeno orgánico se convierte en NH₄⁺
ii) Destilación: el NH₄⁺ se destila y se retiene en un recipiente receptor
iii) Valoración: se determina el contenido de nitrógeno

Digestión
El objetivo del procedimiento de digestión es romper todos los enlaces de nitrógeno de la muestra y convertir todo el nitrógeno enlazado orgánicamente en iones de amonio (NH₄⁺).
El carbono orgánico digerido con ácido sulfúrico forma dióxido de carbono y agua. En este proceso la materia orgánica se carboniza, lo que se puede visualizar por la transformación de la muestra en espuma negra. Durante la digestión, la espuma se descompone y finalmente un líquido claro indica la finalización de la reacción química. Para ello, la muestra se mezcla con ácido sulfúrico a temperaturas entre 350 y 380 °C. Cuanto mayor sea la temperatura utilizada, más rápida será la digestión. La velocidad de la digestión puede mejorarse en gran medida mediante la adición de sales y catalizadores. El sulfato de sodio y/o de potasio se añade para aumentar el punto de ebullición del ácido sulfúrico y los catalizadores se añaden para aumentar la velocidad y la eficacia del procedimiento de digestión. También se pueden añadir agentes oxidantes como el peróxido de hidrógeno para mejorar aún más la velocidad.

El tiempo de digestión depende de la estructura química de la muestra, la temperatura, las cantidades de sal de sulfato y el catalizador:

CHNO + H₂SO₄ --> (NH₄)₂SO₄ + H₂O

Comentarios: reacción catalítica; compuestos orgánicos: proteínas, aminoácidos, péptidos, aminas, amidas, ...
Una vez finalizada la digestión, la muestra se deja enfriar a temperatura ambiente, se diluye con agua y se transfiere a la unidad de destilación.
En las aplicaciones generales de alimentos y piensos, se utiliza ácido sulfúrico al 98% para las digestiones. También se pueden añadir agentes oxidantes para mejorar aún más la velocidad. El peróxido de hidrógeno es el más utilizado, ya que acelera la descomposición de la materia orgánica y tiene una acción antiespumante para controlar la espuma durante la digestión, especialmente ventajosa cuando la muestra contiene grasas o hidratos de carbono. Sin embargo, el uso de peróxido de hidrógeno, que es altamente reactivo en presencia de ácido sulfúrico, puede causar la pérdida de nitrógeno como gas N₂. Por lo tanto, el peróxido de hidrógeno sólo se recomienda cuando hay una mejora apreciable en el tiempo de digestión, y debe añadirse a la muestra gradualmente. Si el único problema es la formación de espuma, es mejor utilizar de 1 a 3 gotas de una emulsión antiespumante patentada. Después de la digestión y antes de la neutralización del ácido sulfúrico mediante la adición de hidróxido de sodio concentrado, se deja enfriar la muestra a temperatura ambiente y se diluye con agua destilada. Esto se hace para evitar la salpicadura de la muestra debido a la ebullición inducida por el calor de reacción disipado cuando se mezclan el ácido y la base concentrados. Además, si las muestras se diluyen con 10-20 mL de agua justo después del enfriamiento, se puede evitar la cristalización.

Preparación de la muestra
Preparación de la muestra: la muestra debe ser homogénea, ya que el peso real de la muestra que se va a utilizar depende del contenido de nitrógeno, así como de la homogeneidad. Durante la digestión las sustancias orgánicas son destruidas por el ácido sulfúrico. Los catalizadores Kjeldahl en pastillas aumentan el punto de ebullición de la mezcla y hacen que el proceso sea más rápido. El peso real de la muestra depende de:

● El contenido de nitrógeno: a mayor contenido de N, menor peso.
● La homogeneidad de la muestra: si la muestra no es homogénea se puede reducir el impacto de esto aumentando el peso. Menos de 1 g para una muestra homogénea. Mayor peso > 2 g para muestras no homogéneas.
● La concentración del valorante: el consumo de valorante debe estar aproximadamente entre 5-15 mL.

A continuación, hay que añadir a la muestra productos químicos: ácido sulfúrico y catalizadores.
La cantidad de ácido sulfúrico a utilizar viene dada por:

● Conversión a K₂SO₄ (K₂SO₄ is un componente de las tabletas).
● Consumo de ácido sulfúrico por la materia orgánica.
● Pérdidas originadas por la evaporación durante la ebullición (1 mL por hora de ebullición).
● Volumen restante considerando el volumen de las pastillas y el ácido sulfúrico utilizado.

El uso de los catalizadores es para la aceleración de la reacción mediante el aumento del punto de ebullición de la mezcla y un efecto de catálisis del metal.

Catalizadores Kjeldahl
Los catalizadores Kjeldahl son típicamente tabletas o polvo compuesto por más del 97% de una sal que aumenta la temperatura de ebullición del ácido sulfúrico y 1-3% de un tipo de catalizador o una mezcla de catalizadores para aumentar la velocidad y la eficiencia del procedimiento de digestión. Los catalizadores típicos son el selenio o las sales metálicas de cobre o titanio. La selección de un catalizador concreto depende de aspectos ecológicos y tóxicos o de razones más prácticas como el tiempo de reacción o la formación de espuma y salpicaduras. Por ejemplo, el catalizador Wieninger que contiene selenio reacciona más rápidamente, pero es tóxico, mientras que un catalizador que contiene cobre, como Missouri, es considerablemente más seguro tanto para los seres humanos como para el medio ambiente, pero proporciona un proceso de digestión más lento. Un compromiso ideal es el catalizador mixto compuesto por cobre y sulfato de titanio.

La selección del catalizador depende de varios factores como:

● Tiempo necesario para la digestión.
● Consideraciones ecológicas.
● Consideraciones de seguridad.
● Si hay formación de espuma en la muestra.

Las condiciones típicas para las muestras que no necesitan condiciones específicas son un punto de ebullición de 370 ºC, sin pérdidas de nitrógeno y un tiempo mínimo necesario. Esto se consigue utilizando 2 mL de ácido sulfúrico más 1 g de catalizadores.

Consejos para la digestion
● Las condiciones óptimas se alcanzan cuando la zona de condensación queda 5 cm por debajo de la constricción del tubo de muestra.
● Para las muestras espumosas se puede utilizar "Antifoam" o ácido esteárico.
● Para reducir el tiempo de digestión se puede añadir H₂O₂.
● Uso mínimo de productos químicos utilizando micro-Kjeldahl cuando sea posible.
● En el caso de las muestras líquidas, las varillas de ebullición evitan los retrasos en la ebullición.
● El aumento lento de la temperatura de digestión reduce la formación de espuma en las muestras problemáticas.

Resumen de la digestión

Destilación
En general, la muestra ácida se diluye con agua y se neutraliza mediante una solución concentrada de hidróxido de sodio. Durante la etapa de destilación, los iones de amonio (NH₄⁺) se convierten en amoníaco (NH₃) mediante la adición de álcali (NaOH). El amoníaco (NH₃) se transfiere al recipiente receptor por medio de la destilación de vapor. El recipiente receptor del destilado se llena con una solución absorbente para capturar el gas amoníaco disuelto. Las soluciones absorbentes habituales son el ácido bórico acuoso [B(OH)₃] con una concentración del 2 al 4%. También pueden utilizarse otros ácidos, dosificados con precisión, como el ácido sulfúrico o el ácido clorhídrico, para capturar el amoníaco, en forma de iones de amonio solvatados.

(NH₄)₂SO₄ + 2 NaOH à 2 NH₃ (gas) + Na₂SO₄ + 2 H₂O

Procedimiento
● Dilución de la mezcla de digestión ácida con adición de agua.
● Alcalinización para convertir NH₄⁺ en NH₃ con adición de hidróxido de sodio
● Destilación de vapor para extraer el NH₃ del recipiente con adición de vapor de agua.
● Recogida de amoníaco en una solución receptora ácida. Este paso puede ser variado, ya que conducirá a una valoración directa con ácido bórico o a una valoración indirecta o por retroceso.

○ Pasos en caso de valoración con ácido bórico:

- Dilución con agua, típicamente 4 mL por mL utilizado de ácido sulfúrico, 2,5 mL cuando se utiliza un auto muestreador. Esto evita reacciones violentas.
- Alcalinización con hidróxido de sodio al 32%. 4,5 mL por mL utilizado de ácido sulfúrico, convirtiendo NH₄⁺ en NH₃.
- Preparación del receptor: utilizar ácido bórico al 2% con KCl para el bajo contenido de N, 0,02 -6,75 mg/tubo de muestra. Utilizar ácido bórico al 4%.
- Pasos en caso de valoración indirecta o por retroceso:

○ Dilución con agua, normalmente 4 mL por mL de ácido sulfúrico utilizado, 2,5 mL en caso de que se conecte un automuestreador. Esto evita reacciones violentas.
○ Alcalinización con hidróxido de sodio 32%, 4,5 mL por mL utilizado de ácido sulfúrico, convirtiendo NH₄⁺ en NH₃.
○ Preparación del receptor: utilizar ácido sulfúrico 0,25 ml/L. El volumen debe ser dosificado con precisión y será normalmente de 20 mL.
○ Destilación con vapor de agua entre 180-300 s para separar el NH₃
○ Recoger la muestra en ácido sulfúrico con amoníaco. La manguera de salida del condensador y el electrodo tienen que estar completamente sumergidos.

Consejos para la destilación
● Después de la digestión, las muestras deben enfriarse a una temperatura de entre 50 y 100°C antes de poder seguir procesándolas.
● La concentración óptima de hidróxido de sodio es del 32%.
● Para contenidos de N muy bajos se debe elegir como solución receptora el ácido bórico al 2% con cloruro de potasio (3 g/L) para lograr límites de detección más bajos.

Resumen de la destilación

Valoración
La concentración de los iones de amonio capturados puede determinarse mediante dos tipos de valoraciones:

1. Cuando se utiliza la solución de ácido bórico como solución absorbente, se realiza una valoración ácido-base utilizando soluciones estándar de ácido sulfúrico o ácido clorhídrico y una mezcla de indicadores. Dependiendo de la cantidad de iones de amonio presentes, se utilizan concentraciones en el rango de 0,01 mol/L a 0,5 mol/L. La detección del punto final puede realizarse manualmente, con una valoración colorimétrica, utilizando una combinación de indicadores. La combinación de indicadores rojo de metilo y azul de metileno se utiliza frecuentemente en muchos métodos. Alternativamente, el punto final puede determinarse potenciométricamente con un electrodo de pH. Esta valoración se denomina valoración directa:

B(OH)₄^- + HX ↔ X^- + B(OH)₃ + H₂O
HX= ácido fuerte (X=Cl^-, etc.)

2. Cuando se utiliza una solución patrón de ácido sulfúrico como solución absorbente, el ácido sulfúrico residual (el exceso que no ha reaccionado con el NH3) se valora con una solución patrón de hidróxido de sodio y por diferencia se calcula la cantidad de amoníaco. El punto final se detecta utilizando un indicador de color. El rojo de metilo suele ser el indicador preferido. Esta valoración se denomina valoración indirecta o por retroceso:

H₂SO₄ (Residual) + 2NaOH à SO₄^2- + 2Na⁺ + 2H₂O

Consejos para la valoración
● Dependiendo de la regulación o del método, puede elegirse una valoración potenciométrica o colorimétrica.
● Para el punto final y la valoración colorimétrica, el pH del ácido bórico debe ajustarse a 4,65.
● La titulación por retroceso puede utilizarse cuando se deba evitar el ácido bórico (sólo para la titulación potenciométrica).
● En el caso de muestras muy conocidas, puede utilizarse un volumen de inicio de la valoración para acelerar el paso de valoración. (Sólo es útil para volúmenes de valoración elevados)
● El proceso de destilación y titulación puede ser sincronizado, por medio de la titulación en línea.

Resumen de la valoración

Cálculos
Los cálculos para el % de nitrógeno o el % de proteína deben tener en cuenta el tipo de solución receptora utilizada y los factores de dilución utilizados durante el proceso de destilación. En las ecuaciones siguientes, "N" representa la normalidad. "mL de blanco" se refiere a los mililitros de base necesarios para valorar por retroceso un blanco de reactivo si el ácido estándar es la solución receptora o se refiere a los mililitros de ácido estándar necesarios para valorar un blanco de reactivo si el ácido bórico es la solución receptora.

Cuando se utiliza ácido bórico como solución receptora la ecuación es:

% Nitrogeno = (mL ácido valorante – mL blanco) x N del ácido x 1.4007 / Peso de la muestra (g)

Cuando se utiliza el ácido estándar como solución receptora, la ecuación es:

% Nitrogen = ((mL ácido valorante x N del ácido) – (mL blanco x N del álcali)) – (mL del álcali x N del álcali) x 1.4007 / Peso de la muestra (g)

Si se desea determinar el % de proteína en lugar del % de nitrógeno, el % N calculado se multiplica por un factor que depende del tipo de proteína presente en la muestra. Podemos encontrar algunos ejemplos en la siguiente tabla*:

* Fuente: Adaptado y modificado de Merrill y Watt (1973)

Más arriba encontrará nuestra oferta de productos de la marca PanReac AppliChem para la determinación del nitrógeno mediante el análisis Kjeldahl. Puede adquirir estos productos a través de nuestra red mundial de distribuidores.
buidores.