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Tampones biológicos - Tampones para ciencias de la vida

Requisitos de los tampones biológicos
Originalmente, se utilizaban diferentes sustancias inorgánicas como tampones, por ejemplo, fosfato, cacodilato, borato y bicarbonato. Más tarde se utilizaron también ácidos orgánicos débiles. Sin embargo, muchas de estas sustancias tampón tienen el inconveniente de que no son inertes y tienen efectos duraderos en el sistema investigado (por ejemplo, inhibición de enzimas, interacciones con sustratos enzimáticos, etc.). La mayoría de los tampones biológicos que se utilizan actualmente fueron desarrollados por Norman E. Good y su equipo de investigación y son tampones de taurina o glicina N-sustituidos. Estas sustancias zwitteriónicas cumplen en gran medida los requisitos o propiedades requeridas para las aplicaciones biológicas.

Solubilidad: El tampón debe ser libremente soluble en agua y poco soluble en otros disolventes. Cuanto mayor sea la solubilidad en agua, más sencillo será preparar soluciones madre concentradas.

Permeabilidad: El tampón no debe ser capaz de permeabilizar las membranas biológicas para evitar una agregación en la célula u orgánulos. El Tris tiene un grado relativamente alto de liposolubilidad y, por tanto, puede permeabilizar las membranas. Esto también explica su toxicidad para muchas células de mamíferos en cultivo.

Fuerza iónica: El tampón no debe alterar significativamente la fuerza iónica del sistema. La fuerza iónica fisiológica está entre 100 - 200 mM de KCl o NaCl. Esto puede ser muy importante, especialmente cuando se investigan reacciones enzimáticas, porque la fuerza iónica de la solución es una medida del medio iónico, que también puede afectar a la actividad catalítica de una enzima. La protonación y desprotonación en función de la composición iónica del medio circundante en el montaje de la reacción afecta a la unión y conversión de un sustrato enzimático por parte de la enzima.

Valor pK_a: El valor pK_a de un tampón debe estar influenciado lo menos posible por la concentración del tampón, la temperatura y la composición iónica del medio. Entre los tampones con valores de pK_a dependientes de la temperatura se encuentran los tampones de aminas, mientras que los tampones de ácidos carboxílicos suelen reaccionar de forma menos sensible a los cambios de temperatura.

Formación de complejos: Cuando un tampón forma complejos con iones metálicos, se liberan protones, lo que hace que el valor de pH disminuya. Sin embargo, el mayor problema suele ser la formación de precipitados insolubles. Si las enzimas necesitan los iones metálicos para su actividad, éstas se verían inhibidas. Por lo tanto, los complejos deben ser solubles y debe conocerse su constante de unión. Los fosfatos, por ejemplo, forman sales insolubles con los metales divalentes y precipitan. La solución salina tamponada con fosfatos (PBS) nunca se autoclava con Ca²⁺ o Mg²⁺ por esta razón. Los tampones de Good, como PIPES, TES, HEPES y CAPS tienen constantes de unión a metales muy bajas y, por tanto, son especialmente adecuados para investigar las enzimas dependientes de metales.

Sustancias inertes: El tampón no debe estar sujeto a cambios enzimáticos ni no enzimáticos, es decir, no debe ser un sustrato/inhibidor de enzimas ni reaccionar con metabolitos u otros componentes. Por lo tanto, el tampón debe ser inerte. El fosfato y el pirofosfato son a la vez sustratos e inhibidores de diferentes reacciones enzimáticas (inhibición de la carboxipeptidasa, la ureasa, diversas quinasas, diversas deshidrogenasas). El borato forma complejos covalentes con mono y oligosacáridos, subunidades de ribosa de los ácidos nucleicos, glicerol y nucleótidos de piridina. El bicarbonato está en equilibrio con el CO₂ y por tanto necesita un sistema cerrado. El Tris y otras aminas primarias como la glicina pueden formar bases de Schiff con aldehídos y cetonas. También interfieren en el ensayo de proteínas de Bradford. La tricina es fotooxidada por las flavinas, por lo que la luz del día es suficiente para reducir la actividad de las enzimas de las flavinas. El HEPES, el HEPPS y la bicina interfieren con los ensayos de proteínas de Lowry. Los tampones basados químicamente en el anillo de piperazina pueden formar radicales en determinadas circunstancias.

Absorción UV: Los tampones no deben absorber ninguna luz a longitudes de onda superiores a 230 nm, ya que muchas investigaciones espectrofotométricas se realizan en este rango (determinación de las concentraciones de ADN, ARN y proteínas). El ADA, por ejemplo, tiene una absorción de 0,1 a 260 nm. Si los tampones interfieren con los análisis fotométricos, deben neutralizarse o ajustarse al pH óptimo del sistema de ensayo (Lowry pH 10; BCA pH 11; Bradford pH 1; oro coloidal pH 3). Si esto no es posible, las proteínas pueden precipitarse con ácido tricloroacético, ácido perclórico o acetona, por ejemplo, y luego pueden redisolverse en un disolvente que no interfiera.

Criterios de selección
Selección del tampón para el rango de pH correcto
El valor de pK_a del tampón debe estar en el rango de pH óptimo para el sistema de ensayo. Si es probable que el pH aumente durante el experimento, debe elegirse un tampón con un valor de pK_a ligeramente superior al óptimo al comienzo del experimento. Por el contrario, si se espera que el valor del pH disminuya durante el experimento, se debe elegir un tampón con un valor de pK_a ligeramente inferior.

Determinación del pH óptimo de una enzima
Si se va a investigar una enzima, el primer paso suele ser determinar las condiciones en las que la enzima mostrará el mayor grado posible de estabilidad y actividad. Para determinar el pH óptimo es aconsejable utilizar inicialmente tampones que cubran un amplio espectro de pH, por ejemplo MES, PIPES, HEPES, TAPS, CHES y CAPS. Una vez identificado el pH óptimo, pueden probarse otros tampones (por ejemplo, para el valor de pH 7,5: TES, TEA o fosfato), para poder descartar o minimizar los efectos inespecíficos de los tampones en investigaciones posteriores. El valor pK_a de un tampón, es decir, el punto medio de su rango de pH, debería estar lo más cerca posible del valor de pH deseado para el tampón utilizado. En otras palabras, el pK_a debe corresponder al pH óptimo de la enzima en cuestión. Las formas protonadas (ionizadas) de los tampones de amina tienen menos efectos inhibidores que las formas no protonadas. Por lo tanto, para los tampones Tris y zwitteriónicos suele ser más adecuado un rango de trabajo ligeramente inferior al valor pK_a, mientras que, por el contrario, son más adecuados los tampones de ácidos carboxílicos con un rango de trabajo ligeramente superior a sus valores pK_a, ya que estos tampones están compuestos principalmente por la forma ionizada.

Determinación de la concentración óptima del tampón
A menudo, la capacidad tampón adecuada sólo se alcanza con concentraciones superiores a 25 mM. Sin embargo, las concentraciones de tampón más altas y las fuerzas iónicas altas relacionadas pueden inhibir la actividad enzimática. Por lo tanto, las concentraciones iniciales adecuadas están entre 10 y 25 mM. Si, tras la adición de la proteína o la enzima, el valor del pH cambia en más de 0,05 unidades, la concentración del tampón puede aumentarse primero a 50 mM. Hasta esta concentración, no se observaron interferencias con los tampones Good en los experimentos de cultivo celular. Para formar complejos con metales pesados, se puede añadir EDTA.

Elección de sustancias tampón en función de la aplicación
La decisión a favor o en contra de un tampón también depende del método para el que se utiliza. Además de la medición de la actividad, se suele determinar la concentración de proteínas tras los procesos de aislamiento o purificación. Muchas de las sustancias tampón basadas en aminoácidos pueden dar lugar a resultados falsos positivos en los ensayos de proteínas (por ejemplo, Lowry) debido a las interacciones con los reactivos o a la absorción de la propia sustancia tampón en el rango superior a 230 nm. Sin embargo, estas interferencias pueden suprimirse fácilmente mediante la inclusión del tampón en el control en blanco.

Muchos tampones son básicamente adecuados para la filtración en gel. Para la cromatografía de intercambio aniónico se prefieren los tampones catiónicos, como el Tris. Los tampones aniónicos (como el fosfato o el MES) se prefieren para la cromatografía de intercambio catiónico o la cromatografía de hidroxiapatita, es decir, el tampón debe tener la misma carga que el material de intercambio iónico, para evitar que se una al intercambiador de iones.
El borato no es adecuado para el aislamiento de glicoproteínas o sistemas que incluyen nucleótidos, ya que interactúa con el grupo cis-hidroxilo de los azúcares. Si la electroforesis se realiza después de la disolución de la proteína en los sistemas de purificación de proteínas, debe utilizarse un tampón con una fuerza iónica baja, ya que una fuerza iónica alta calentaría el gel.

Los tampones de Good basados en el anillo de piperazina, HEPES, HEPPS, HEPPSO y PIPES, no son adecuados para la investigación de los procesos redox, ya que, en presencia de H₂O₂, radicales de oxígeno, hierro autooxidante o, en determinadas condiciones electrolíticas, forman fácilmente radicales. En cambio, el tampón de Good basado en un anillo de morfolina, MES, no forma radicales.

Ajustando el pH
Los tampones están formados por un ácido y su base conjugada. La calidad de un tampón viene determinada por su capacidad tampón, es decir, su resistencia a los cambios de pH cuando se añaden ácidos o bases fuertes. En otras palabras, la capacidad tampón corresponde a la cantidad de iones H⁺ u OH^- que puede neutralizar el tampón. La capacidad tampón está relacionada con la concentración del tampón y alcanza su máximo en el valor pK_a. Este valor corresponde al punto medio del intervalo de pH cubierto por el tampón (la concentración de ácido y base es igual). En consecuencia, cantidades relativamente grandes de iones H⁺/OH^- sólo producen pequeños cambios en el pH. Un tampón con un valor de pH una unidad de pH por encima o por debajo de su valor de pK_a ya no muestra capacidad tampón.

El ajuste del valor de pH no es tan fácil como parece a primera vista. Hay una serie de hechos que influyen en la concentración de protones y que afectan al funcionamiento del tampón:

Ácido/Base: Normalmente, el valor del pH se ajusta con NaOH/KOH o HCl. La adición lenta del ácido o la base mientras se agita enérgicamente evita concentraciones localmente altas de iones H⁺ u OH^-. Si no se hace así, las sustancias tampón pueden sufrir cambios químicos que las inactiven o puedan tener un efecto inhibidor en su forma modificada. Si un tampón está disponible en la forma protonada (ácido) y en la forma no protonada (base), se recomienda fijar el valor del pH mezclando las dos sustancias.
Si los cationes monovalentes interfieren con la reacción o deben investigarse, el valor del pH puede fijarse con hidróxido de tetrametilo o tetraetilamonio. En lugar de HCl puede utilizarse acetato, sulfato o glutamato, aunque en este caso el riesgo de interferencia con una enzima es especialmente alto.

Temperatura: Dependiendo de la sustancia tampón, su pH puede variar con la temperatura. Por lo tanto, es aconsejable ajustar el pH a la temperatura de trabajo utilizada posteriormente. El valor fisiológico del pH para la mayoría de las células animales a 37 °C está entre 7,0 y 7,5. Un tampón especialmente susceptible a los cambios de temperatura es el Tris. Si se ajusta a 7,5 a 37 °C, aumenta hasta aproximadamente 8,5 a 0 °C. Los tampones de Good suelen tener un bajo grado de sensibilidad a la temperatura, y los tampones de ácidos carboxílicos (citrato, formiato, succinato) son aún menos sensibles.

Aditivos: Si se añaden otros componentes al tampón (por ejemplo, EDTA, DTT, Mg²⁺), también hay que esperar cambios en el pH y debe volver a medirse.

Fuerza iónica: El ajuste de la fuerza iónica de una solución tampón (si es necesario) debe realizarse de la misma manera que el ajuste del valor de pH al seleccionar el electrolito. La fuerza iónica depende del electrolito. Las sales de tetrametilamonio o tetraetilamonio son adecuadas para el ajuste de la fuerza iónica, ya que los cationes más grandes no interactúan tan bien con las cargas negativas de las enzimas. El acetato, como anión grande, tiene una mala interacción con los metales alcalinos.

pH-metro: Hoy en día, existen pH-metros precisos con pantalla digital para el ajuste del pH de un tampón. La calibración del pH-metro debe realizarse utilizando al menos dos soluciones tampón estándar que abarquen el rango de valores de pH que se desea medir. Si hay dudas sobre la precisión del aparato, se puede resolver simplemente calibrándolo con una solución tampón de fosfato 50 mM, que se diluye 10 veces. El valor del pH debería ser entonces 0,2 unidades de pH más alto.
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