Proteinasa K, recombinante

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Sobre la proteinasa K
En biología molecular, la proteinasa K (EC 3.4.21.64, proteasa K, endopeptidasa K, proteinasa alcalina de Tritirachium, proteinasa de serina de Tritirachium album, proteinasa K de Tritirachium album) es una proteasa de serina de amplio espectro. La enzima se descubrió en 1974 en extractos del hongo Engyodontium album (antes Tritirachium album). La proteinasa K puede digerir el cabello (queratina), de ahí el nombre de "proteinasa K". El sitio de escisión predominante es el enlace peptídico junto al grupo carboxilo de los aminoácidos alifáticos y aromáticos con grupos bloqueados alfa-amino. Se utiliza a menudo por su amplia especificidad. La proteinasa K pertenece a la familia de las peptidasas S8 (subtilisina). El peso molecular de la proteinasa K es de 28.900 daltons (28,9 kDa).

Actividad de la proteinasa K
Activada por el calcio, la enzima proteinasa K digiere las proteínas preferentemente por los aminoácidos hidrofóbicos (alifáticos, aromáticos y otros aminoácidos hidrofóbicos). Los iones de calcio no influyen en la actividad de la enzima, pero contribuyen a su estabilidad. Las proteínas se digieren completamente si el tiempo de incubación es largo y la concentración de proteasa es lo suficientemente alta. Si se eliminan los iones de calcio, se reduce la estabilidad de la enzima, pero se mantiene la actividad proteolítica. La proteinasa K tiene dos sitios de unión para el Ca2+, que están cerca del sitio activo, pero no están directamente involucrados en el mecanismo catalítico. La actividad residual es suficiente para digerir las proteínas que normalmente contaminan las preparaciones de ácidos nucleicos. Por lo tanto, la digestión con proteinasa K para la purificación de ácidos nucleicos suele realizarse en presencia de EDTA (inhibición de enzimas dependientes de iones metálicos como las nucleasas).

Estabilidad de la proteinasa K
La proteinasa K es estable en un amplio rango de pH (4-12), siendo el óptimo de pH 8,0. El aumento de la temperatura de reacción de 37 °C a 50-60 °C puede multiplicar la actividad varias veces, al igual que la adición de 0,5-1% de dodecil sulfato de sodio (SDS) o de guanidinio cloruro (3 M), de guanidinio tiocianato (1 M) y urea (4 M). Las condiciones anteriores aumentan la actividad de la proteinasa K al hacer más accesibles los sitios de escisión de su sustrato. Las temperaturas superiores a 65 °C, el ácido tricloroacético (TCA) o los inhibidores de la serina proteasa AEBSF, PMSF o DFP inhiben la actividad. La proteinasa K no es inhibida por el cloruro de guanidinio, el tiocianato de guanidinio, la urea, el sarcosilo, el Tritón X-100, el Tween 20, el SDS, el citrato, el ácido yodoacético, el EDTA ni por otros inhibidores de la serina proteasa como la Nα-tosil-Lys clorometilcetona (TLCK) y la Nα-tosil-Phe clorometilcetona (TPCK).

Aplicaciones de la proteinasa K
La proteinasa K se utiliza ampliamente en biología molecular para digerir proteínas y eliminar impurezas de las preparaciones de ácidos nucleicos. Al añadir proteinasa K a las preparaciones de ácidos nucleicos, se inactivan rápidamente las nucleasas que, de otro modo, podrían degradar el ADN o el ARN durante la purificación. Es muy adecuada para esta aplicación porque la enzima es activa en presencia de productos químicos que desnaturalizan las proteínas, como el SDS y la urea, agentes quelantes como el EDTA, reactivos sulfhídricos e inhibidores de tripsina o quimotripsina. La proteinasa K se utiliza para la destrucción de proteínas en lisados celulares (tejidos, células de cultivo celular) y para la liberación de ácidos nucleicos, ya que inactiva las DNasas y las RNasas con gran eficacia. Algunos ejemplos de aplicaciones: La proteinasa K es muy útil en la purificación de ADN o ARN altamente naturales y no dañados, ya que la mayoría de las DNasas y RNasas microbianas o de mamíferos son rápidamente inactivadas por la enzima, especialmente en presencia de 0,5-1% de SDS. La actividad de la enzima hacia las proteínas nativas es estimulada por desnaturalizantes como el SDS. En cambio, cuando se mide con sustratos peptídicos, los desnaturalizantes inhiben la enzima. La razón de este resultado es que los desnaturalizantes despliegan los sustratos proteicos y los hacen más accesibles para la proteasa.

Inhibidores de la proteinasa K
La proteinasa K tiene dos enlaces disulfuro, pero muestra una mayor actividad proteolítica en presencia de agentes reductores (por ejemplo, 5 mM de DTT), lo que indica que la presunta reducción de sus propios enlaces disulfuro no conduce a su inactivación irreversible. La proteinasa K es inhibida por inhibidores de las proteasa de serina como el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), el fluorofosfato de diisopropilo (DFP) o el fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo (AEBSF). La actividad de la proteinasa K no se ve afectada por los reactivos modificadores de los sulfitos, como el ácido para-cloromercuribenzoico (PCMB), la N-alfa-tosil-L-lisil clorometil cetona (TLCK) o la N-alfa-tosil-l-fenilalanina clorometil cetona (TPCK), aunque es probable que se inhiba cuando estos reactivos se utilizan junto con reactivos de disulfuro reductores que exponen los tioles normalmente no disponibles de la proteinasa K.

FAQs

¿Cómo se inactiva la proteinasa K?

La inactivación de la proteinasa K es quizás una de las preguntas más comunes que recibimos. Y la respuesta es muy sencilla. El calor es un método muy utilizado para inactivar la proteinasa K. Mientras que la actividad de la proteinasa K aumenta con la temperatura y se optimiza a unos 65 ˚C, el calentamiento a 95 ˚C durante 10 minutos inactiva la proteinasa K. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el calentamiento de la proteinasa K no inactiva completamente la enzima. Con este método siempre queda una pequeña cantidad de actividad. También pueden utilizarse inhibidores de la proteasa, como el PMSF y el AEBSF (Pefabloc®), para inactivar la proteinasa K de forma permanente. Nota: La temperatura de inactivación real es controvertida y oscila entre 70 y 95 ˚C. Sin embargo, basándonos en los comentarios del público y en una amplia investigación, hemos decidido que la mejor temperatura para la inactivación es 95 ˚C.

¿Cuál es la temperatura óptima para la activación de la proteinasa K?

Como se mencionó en la pregunta 1, la actividad de la proteinasa K aumenta con la temperatura (hasta cierto punto). La temperatura óptima para la actividad está entre 50-65 ˚C. Las temperaturas más elevadas favorecen el desdoblamiento de las proteínas y facilitan que la proteinasa K las degrade. Pero optimizar la proteinasa K puede no ser lo más importante en su proceso. A veces, las técnicas especiales requieren temperaturas adaptadas para lograr los mejores resultados generales. Por lo tanto, también debe tener en cuenta que, aunque el rango de temperatura informado para la actividad de la proteinasa K es amplio, la enzima sigue siendo activa a temperaturas entre ~20-65 ˚C, y que esta amplia flexibilidad de temperatura puede ser útil para métodos muy específicos que esté realizando. A temperaturas superiores a 65 ˚C, existe el riesgo de que la proteinasa K se inactive.

¿Cuál es exactamente la relación entre la proteinasa K y el calcio?

La proteinasa K se une a dos iones Ca2+ que ayudan a mantener la estabilidad de la enzima, especialmente cuando se expone a temperaturas elevadas. El calcio también protege a la proteína K de la autolisis. El calcio/calor ayuda a mantener la termoestabilidad de la proteinasa K, pero no es necesario para la actividad proteolítica. Según Richard Tullis y Harvey Rubin, esta relación se vuelve aún más interesante cuando interviene la DNasa I. Se sabe que la proteinasa K inactiva las DNasas y las RNasas, pero cuando la DNasa I está en presencia de Ca2+, está protegida de la proteinasa K (concentración de 1 mg/mL). La RNasa, por otro lado, se inactiva tanto si hay presencia de Ca2+ como si no. Sus resultados sugieren un método para tratar la RNasa contaminada sin DNasaI o para purificar el ARN altamente polimerizado.

¿Inactiva el EDTA la proteinasa K?

Esta cuestión también parece surgir con frecuencia cuando se trata de la proteinasa K. Los quelantes como el EDTA o el EGTA no tienen ningún efecto directo sobre la actividad enzimática de la proteinasa K. La razón para utilizar el EDTA con la proteinasa K durante la purificación del ADN o del ARN suele ser la de eliminar el calcio (véase también la pregunta nº 3). Sin embargo, dado que el calcio/calcemia está relacionado con la estabilidad de la proteinasa K, la adición de EDTA puede afectar al calcio y, por tanto, reducir la actividad de la proteinasa K en cierta medida.

¿Cuáles son los activadores de la proteinasa K?

Los activadores de la proteinasa K son el SDS (sodio dodecilo sulfato) y la urea. En general, la proteinasa K se vuelve más estable y activa en los tampones que contienen estos activadores.

¿Cómo interviene la proteinasa K en la lisis celular?

Para responder a esta pregunta, primero hay que saber qué es la proteinasa K. Se trata de una proteasa de amplio espectro capaz de digerir una amplia gama de proteínas nativas (véase más abajo para más detalles). En la lisis celular, especialmente en el posterior aislamiento y purificación del ADN, la proteinasa K puede formar parte de la etapa de lisis digiriendo las proteínas superficiales. Más adelante en el proceso, cuando llega el momento de resuspender y lisar los núcleos en un tampón que contiene proteinasa K, ésta contribuye a la digestión de las proteínas que, de otro modo, degradarían la muestra.

¿Por qué muchas recetas de tampones de extracción de ADN exigen el uso de proteinasa K y RNasa?

Esta pregunta surge una y otra vez porque la sugerencia parece una contradicción. Se sabe que la proteinasa K digiere las RNasas. Entonces, ¿por qué poner los dos juntos en un tampón de lisis? En primer lugar, se quiere añadir la RNasa porque degradaría el ARN contaminante durante la purificación del ADN. Y quieres usar la proteinasa K porque puede degradar las proteínas dañinas, las DNasas y las RNasas. La respuesta a esta pregunta es una cuestión de tiempo y optimización. Algunos investigadores sugieren añadir primero la RNasa y darle tiempo para que actúe. A continuación, se puede añadir proteinasa K y SDS para degradar las proteínas no deseadas. Algunos protocolos requieren que se incube el SDS, la proteinasa K y la RNasa a 37 ˚C durante un tiempo determinado. Dado que la actividad de la proteinasa K no está tan optimizada a esta temperatura, esto probablemente le da a la RNasa más tiempo para trabajar. Los pasos posteriores del protocolo sugieren una segunda incubación a 55 ˚C durante un periodo de tiempo más largo, que sería una temperatura óptima para la actividad de la proteinasa K y le permitiría digerir otras proteínas no deseadas.

¿Para qué aplicaciones se utiliza la proteinasa K?

La proteinasa K es una proteasa de serina de amplio espectro que pertenece a la clase de las proteasas similares a la subtilisina (hay dos tipos de proteasas de serina, similares a la quimotripsina y similares a la subtilisina). Como proteasa de amplio espectro, se utiliza principalmente para el aislamiento de ácidos nucleicos: ADN genómico, ARN citoplasmático, ADN y ARN de alta natividad, etc. Es ideal para estas aplicaciones porque la proteinasa K es capaz de degradar las proteínas e inactivar las DNasas y RNasas que, de otro modo, degradarían una muestra de ADN o ARN deseada. Para simplificar la lista, la proteinasa K se utiliza para: digestión de proteínas no deseadas en aplicaciones de biología molecular, eliminación de endotoxinas unidas a proteínas catiónicas como la lisozima y la RNasaA, eliminación de nucleasas para hibridación in situ, investigación de priones relacionada con las EET (encefalopatías espongiformes transmisibles), huella de proteasas, purificación mitocontrial, purificación de ADN genómico, purificación de ARN citoplasmático, purificación de ADN o ARN de alta natividad.

¿Cómo debe almacenarse la proteinasa K/cuál es la vida útil de la proteinasa K?

Solución madre: normalmente las soluciones madre son estables a -20 ˚C hasta 1 año. Polvo liofilizado: normalmente seco a -20 ˚C hasta 2 años. No obstante, se aplican las disposiciones de los respectivos certificados de análisis del fabricante, que pueden diferir de esta declaración. ¿En qué se puede disolver la proteinasa K / Cómo disolver la proteinasa K? La proteinasa K es muy soluble en agua y también puede disolverse en Tris o PBS. Sin embargo, cuando se trabaja con PBS puede ser un poco difícil, posiblemente debido al pH (todavía en el rango óptimo, pero en el extremo inferior de este rango). Por lo general, la adición de proteinasa K en polvo en pequeñas cantidades al agitarla en la solución ayuda a disolverla en el PBS.

¿Cómo se inactivan las nucleasas con proteinasa K?

Se sabe que la proteinasa K protege a los ácidos nucleicos de la degradación de las proteínas. Esto sucede porque la proteinasa K es capaz de digerir las proteínas que normalmente dañarían su muestra. Este protocolo explica con más detalle cómo utilizar la proteinasa K para inactivar las nucleasas durante sus procedimientos de extracción.

¿Existe alguna alternativa al uso de proteinasa K en las extracciones de ADN?

La ventaja de utilizar la proteinasa K en la extracción de ADN es que puede degradar una variedad de nucleasas dañinas. También es excelente para digerir las proteínas superficiales de la membrana celular. Sin embargo, si esta pregunta es específicamente pretende aislar el ADN de otras proteínas, la extracción con fenol-cloroformo es otra opción adecuada para eliminar las proteínas de una solución. Sin embargo, este método es más tóxico.

¿Qué tiene que ver la proteinasa K con las enfermedades priónicas o las EET?

La proteinasa K participa en la distinción entre la PrP C normal (proteína priónica/proteína resistente a la proteína) y la PrPSC (isoforma causante de la enfermedad). Tanto la PrPC como la PrPSC tienen el mismo peso molecular, pero la PrPSC es resistente a la proteinasa K. Las muestras que podrían contener ambas se tratan con proteinasa K, que elimina la PrPC y convierte la PrPSC en PrPRES, que tiene un peso molecular más bajo y puede ser peleada y, por tanto, distinguida.

¿Cuál es el peso molecular de la proteinasa K?

El peso molecular de la proteinasa K es de 28,5 kDa.

¿Cuál es el valor de pH óptimo para la proteinasa K?

La proteinasa K es activa a un pH entre 7,5 y 12,0.

¿Cuál es la secuencia primaria de la proteinasa K?

GAAQTNAPWGLARISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEASHPEFEGRAQMVKTYYSSRDG
NGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGYSTIIAGMDFVASDKNNRNCPKGVVASLSLGGGYSVNSAAARLQSSGVMVAAGNNADARNYSPASE
PSVCTVGASDRYRSSFSNYGSVLDIFGPGTSILSTWIGGSTRSISGTSMATPHVAGLAAYLMTLGKTTAASACRYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQA

¿Qué es la proteinasa K?

Hemos decidido dejar esta pregunta para el final, sobre todo porque la respuesta se encuentra fácilmente en nuestro sitio web y se insinúa en esta página. Sin embargo, la cuestión merece su propio espacio aquí. La proteinasa K es una proteasa de serina de amplio espectro que pertenece a la familia de las subtilisinas. Es conocido en la investigación por su capacidad de inactivar las RNasas y las DNasas que dañarían las muestras de ácidos nucleicos deseadas durante la extracción. Su nombre se debe a su capacidad originalmente descubierta de hidrolizar la queratina.

¿Por qué se utiliza la proteinasa K en la extracción de ADN?

La proteinasa K se utiliza en la extracción de ADN para digerir muchas proteínas contaminantes presentes. También degrada las nucleasas que pueden estar presentes durante la extracción del ADN y protege los ácidos nucleicos del ataque de las nucleasas.

¿Cuáles son las aplicaciones de la proteinasa K?

Aplicaciones de las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) y de microarrays: Purificación del ácido nucleico mediante la inactivación de nucleasas en la extracción de ADN y ARN a partir de lisados de levaduras, bacterias, células de mamíferos y células vegetales, Mejora de la eficacia de la clonación de productos de PCR, Preparación de muestras para la cuantificación de los niveles de aductos de ADN mediante espectrometría de masas con acelerador, Inactivación de cócteles de enzimas en ensayos de protección contra ribonucleas, Adición a los procedimientos de extracción para optimizar el rendimiento del ARN de tumores primarios de mama para estudios de microarrays. Aplicaciones de biología molecular: detección de proteínas de la encefalopatía espongiforme bovina que presentan una resistencia única a la degradación proteolítica. Digestión de tejidos (desnaturalización de proteínas) como preparación alternativa de muestras para el análisis cuantitativo por cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem. Modificación específica de las proteínas de la superficie celular para analizar las estructuras de la membrana para la localización de proteínas, generación de fragmentos de proteínas para la caracterización de estudios funcionales.

¿Cuáles son las directrices para el uso de la proteinasa K?

Aislamiento de ADN de alto peso molecular: el ADN cromosómico que ha sido incrustado en tapones de agarosa puede ser tratado con proteinasa K para inactivar las enzimas de restricción utilizadas para digerir el ADN. La enzima se utiliza para este método a una concentración de 1 mg/mL en un tampón que contiene 0,5 M de EDTA y 1% de N-lauroilsarcosina (v/v). Incubar durante 24-48 horas a 37 °C. Aislamiento del ADN genómico y del plásmido: el ADN genómico o del plásmido puede purificarse de células congeladas con nitrógeno líquido o de células cultivadas utilizando proteinasa K. Incubar 50-100 mg de tejido o 1x108 células en 1 ml de tampón que contenga 0,5% de SDS (p/v) con proteinasa K a una concentración de 1 mg/mL a 50 °C durante 12-18 horas. Aislamiento del ARN: Para el aislamiento del ARN citoplasmático, centrifugar el lisado celular, eliminar el sobrenadante y añadir 200 ug/mL de proteinasa K y SDS al 2% (p/v). Incubar durante 30 minutos a 37 °C. El ARN total puede aislarse separando el lisado antes del tratamiento con el La enzima se extrae a través de una aguja conectada a una jeringa. Inactivación de RNasas, DNasas y enzimas en las reacciones: la proteinasa K es activa en una variedad de tampones. La enzima debe utilizarse en una proporción de aproximadamente 1:50 (p/p, proteinasa K: enzima). Incubar a 37 °C durante 30 minutos.

¿Por qué la digestión se realiza a 50 °C?

Al aumentar la temperatura a 50 °C, algunas proteínas se desdoblan para que puedan ser degradadas más fácilmente por la proteinasa K. La enzima es estable y su actividad aumenta. La enzima es estable y su actividad aumenta considerablemente al añadir desnaturalizantes como el SDS y la urea.

¿Cuál es la forma más rápida y eficaz de inactivar la proteinasa K?

Como ocurre con la mayoría de las proteínas, la forma más eficaz de inactivar la enzima es aumentar la temperatura o cambiar significativamente el pH. La proteinasa K se inactiva por el calor (por ejemplo, incubación a 55 °C). ¿Cómo se puede saber si la enzima está funcionando? Para determinar si la enzima está funcionando, puede realizar los siguientes 2 pasos: Determine cuántas micromoles de la p-nitroanilida se producen por minuto. A continuación, dividir por la cantidad total de proteínas en la solución. De esta manera se puede determinar la actividad específica de la enzima = unidades (una unidad equivale a 1 mol de p-nitroanilida producida por minuto), actividad específica = unidades de actividad enzimática/mg de proteína total.

¿Dónde se escinde la proteinasa K?

La proteinasa K escinde los enlaces peptídicos además del grupo carboxilo de los aminoácidos hidrofóbicos, alifáticos y aromáticos sustituidos por N. También escinde amidas peptídicas.

¿Cuál es la vida útil de la proteinasa K?

La proteinasa K tiene una vida útil de 6 meses si se almacena en un lugar seco a 4-8 °C, ya que es muy estable. El almacenamiento a corto plazo a temperatura ambiente no afectará a la actividad y estabilidad de la proteinasa K. No obstante, se aplican las condiciones del fabricante en los certificados de análisis.

¿Cuál es el papel de la proteinasa K en el análisis de Covid-19?

La proteinasa K desempeña un papel importante en la preparación de las muestras para las pruebas PCR de detección de Covid-19. La función de la proteinasa K es la digestión de las proteínas de la muestra, en particular las nucleasas, que de otro modo promoverían la degradación del ADN y el ARN de la muestra y, por tanto, falsearían el resultado final de la prueba.

¿Dónde se encuentra la proteinasa en la naturaleza?

La proteinasa se descubrió por primera vez en 1974 en los extractos del hongo Engyodontium album (antes Tritirachium album).

Literature

[1] Betzel C, Singh TP, Visanji M, Peters K, Fittkau S, Saenger W, Wilson KS (julio de 1993). "Estructura del complejo de la proteinasa K con un inhibidor hexapéptido análogo al sustrato a resolución 2,2-A". J. Biol. Chem. 268 (21): 15854-8. [2] Morihara K, Tsuzuki H (1975). "Especificidad de la proteinasa K de Tritirachium album Limber para péptidos sintéticos". Agric. Biol. Chem. 39 (7): 1489-1492. [3] Kraus E, Kiltz HH, Femfert UF (febrero de 1976). "La especificidad de la proteinasa K contra la cadena B de la insulina oxidada". Z de Hoppe-Seyler. Physiol. Chem. 357 (2): 233-7. [4] Jany KD, Lederer G, Mayer B (1986). "Secuencia de aminoácidos de la proteinasa K del moho Tritirachium album Limber". FEBS Lett. 199 (2): 139-144. [5] Ebeling W, Hennrich N, Klockow M, Metz H, Orth HD, Lang H (agosto de 1974). "Proteinasa K de Tritirachium album Limber". Eur. J. Biochem. 47 (1): 91-7. [6] Müller A, Hinrichs W, Wolf WM, Saenger W (septiembre de 1994). "Estructura cristalina de la proteinasa K sin calcio con una resolución de 1,5 A". J. Biol. Chem. 269 (37): 23108-11. [7] Hilz H, Wiegers U, Adamietz P (1975). "Estimulación de la acción de la proteinasa K mediante desnaturalizantes: aplicación al aislamiento de ácidos nucleicos y a la degradación de proteínas 'enmascaradas'". Revista Europea de Bioquímica. 56 (1): 103-108. [8] Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (1995) Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing & Wiley-Interscience, Nueva York [9] Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning\: A Laboratory Manual, 2nd Edition page B16. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. [10] Müller, A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 23108-23111 Crystal Structure of Calcium- proteinasa K libre con una resolución de 1,5 A. [11] Wallace, D.M. (1987) Methods Enzymol. 152, 41-48 Extracción de fenol a pequeña y gran escala. [11] Breyer, J., Wemheuer, W. M., Wrede, A., Graham, C., Benestad, S. L., Brenig, B., . Schulz-Schaeffer, W. J. (2012).