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Tampons biologiques - Tampons pour les Sciences de la Vie

Exigences relatives aux tampons biologiques
A l'origine, différentes substances inorganiques étaient utilisées comme tampons (par ex. phosphate, cacodylate, borate, bicarbonate et autres), complétées plus tard par des acides organiques faibles. Beaucoup de ces substances tampons présentent toutefois l'inconvénient de ne pas être inertes et d'influencer durablement le système à étudier (par ex. inhibition d'enzymes, interactions avec des substrats enzymatiques, etc.).
La plupart des tampons biologiques utilisés aujourd'hui ont été développés par Norman E. Good et ses collaborateurs. Il s'agit de tampons de taurine ou de glycine N-substitués. Ces tampons zwitterioniques remplissent la plupart des critères auxquels un tampon biologique doit répondre.

Solubilité : le tampon doit avoir une solubilité élevée dans l'eau et une faible solubilité dans d'autres solvants. Plus la solubilité dans l'eau est élevée, plus il est facile de préparer des solutions mères concentrées.

Perméabilité : le tampon ne doit pas passer à travers les membranes biologiques afin d'éviter une concentration à l'intérieur de la cellule/de l'organite. Le Tris est relativement bien soluble dans les graisses et peut donc traverser les membranes. Cela explique également sa toxicité pour de nombreuses cellules de mammifères en culture.

Force ionique : le tampon doit autant que possible ne pas modifier la force ionique du système. La force ionique physiologique se situe entre 100 et 200 mM KCl ou NaCl. Elle peut jouer un rôle important, en particulier dans l'étude des réactions enzymatiques, car la force ionique de la solution est une mesure du milieu ionique qui peut également influencer l'activité catalytique d'une enzyme. La protonation et la déprotonation en fonction de la composition ionique du milieu environnant dans le mélange réactionnel influencent la liaison et la conversion d'un substrat enzymatique par une enzyme.

Dépendance de la valeur pKa : la valeur pKa d'un tampon doit être influencée le moins possible par la concentration du tampon, la température et la composition ionique du milieu. Parmi les tampons dont le pKa est sensible à la température, on trouve par exemple les tampons amine, tandis que les tampons acide carboxylique sont généralement moins sensibles aux variations de température.

Formation de complexes : Lorsqu'un tampon forme des complexes avec des ions métalliques, des protons sont libérés, ce qui entraîne une baisse de la valeur du pH. Mais le problème le plus important est généralement la formation de précipités insolubles. Si les enzymes ont besoin des ions métalliques pour leur activité, elles seraient inhibées. Les complexes doivent donc être solubles et la constante de liaison connue. Les phosphates, par exemple, forment des sels insolubles avec des métaux divalents et précipitent. La solution saline tamponnée au phosphate (PBS) n'est donc jamais autoclavée avec Ca²⁺ et Mg²⁺. Les tampons de Good tels que PIPES, TES, HEPES et CAPS possèdent des constantes de liaison aux métaux très faibles et sont donc particulièrement adaptés à l'étude des enzymes métal-dépendantes.

Substances inertes : Le tampon ne doit pas subir de modifications enzymatiques ou non enzymatiques, c'est-à-dire qu'il ne doit pas être un substrat/inhibiteur d'enzymes ou réagir avec des métabolites ou d'autres composants. Le tampon doit donc être inerte. Le phosphate ou le pyrophosphate sont à la fois des substrats et des inhibiteurs de différentes réactions enzymatiques (inhibition de la carboxypeptidase, uréase, différentes kinases, différentes déshydrogénases). Le borate forme des complexes covalents avec les mono-/oligosaccharides, les sous-unités de ribose des acides nucléiques, le glycérol ou les nucléotides pyridiniques. Le bicarbonate est en équilibre avec le CO₂ et nécessite donc un système fermé. Le tris et d'autres amines primaires peuvent former des bases de Schiff avec des aldéhydes et des cétones. En outre, elles interfèrent avec la détection des protéines de Bradford (par ex. tris et glycine). La tricine est photo-oxydée par les flavines, de sorte que la lumière du jour suffit à réduire l'activité des enzymes flavines. HEPES, HEPPS et la bicine interfèrent avec la détection des protéines Lowry (foline). Les tampons chimiquement basés sur le cycle de la pipérazine peuvent former des radicaux dans certaines circonstances.

Absorption des UV : les tampons ne doivent pas absorber la lumière de longueurs d'onde supérieures à 230 nm, car de nombreuses analyses spectrophotométriques sont effectuées dans ce domaine (détermination de la concentration d'ADN, d'ARN et de protéines). L'ADA, par exemple, a une absorption de 0,1 à 260 nm. Si les tampons interfèrent avec les détections photométriques, ils doivent être neutralisés ou ajustés au pH optimal du système de test (Lowry pH 10 ; BCA pH 11 ; Bradford pH 1 ; or colloïdal pH 3). Si cela n'est pas possible, les protéines peuvent être précipitées par exemple avec de l'acide trichloracétique, de l'acide perchlorique ou de l'acétone, puis dissoutes à nouveau dans un solvant sans interférences.


Critères de sélection
Sélection du tampon pour la bonne plage de pH
La valeur pK_a du tampon doit se situer dans la plage de pH optimale pour le système d'essai. Si le pH peut augmenter pendant l'expérience, il faut choisir un tampon avec un pK_a légèrement supérieur à l'optimum au début de l'expérience. Inversement, il convient de choisir un tampon avec un pK_a légèrement inférieur si l'on s'attend à ce que le pH diminue pendant l'expérience.

Détermination du pH optimal d'une enzyme
Lorsqu'une enzyme doit être étudiée, la première étape consiste généralement à déterminer les conditions dans lesquelles l'enzyme présente un maximum de stabilité et d'activité. Pour déterminer le pH optimal, il est recommandé d'utiliser d'abord des tampons qui couvrent un large spectre de pH, par exemple MES, PIPES, HEPES, TAPS, CHES et CAPS. Après avoir identifié le pH optimal, d'autres tampons (par exemple pour le pH 7,5 : TES, TEA ou phosphate) peuvent être testés afin d'exclure ou de minimiser les effets non spécifiques des tampons pour les analyses ultérieures. La valeur pK_a d'un tampon, c'est-à-dire le point central de sa plage de pH, devrait être aussi proche que possible de la valeur de pH souhaitée pour le tampon utilisé. En d'autres termes, le pK_a devrait correspondre au pH optimal de l'enzyme à tester. Les formes protonées (ionisées) des tampons aminés ont moins d'effets inhibiteurs que les formes non protonées. Pour les tampons Tris et zwitterioniques, une plage de travail légèrement inférieure à la valeur pK_a est donc généralement plus appropriée, tandis qu'à l'inverse, les tampons d'acide carboxylique avec une plage de travail légèrement supérieure à leurs valeurs pK_a sont plus adaptés, car ces tampons sont principalement constitués de la forme ionisée.

Détermination de la concentration optimale de tampon
Un pouvoir tampon suffisant n'est souvent atteint qu'à des concentrations supérieures à 25 mM. Cependant, des concentrations de tampon plus élevées et les forces ioniques élevées qui y sont associées peuvent inhiber l'activité enzymatique. Les concentrations initiales appropriées se situent donc entre 10 et 25 mM. Si le pH varie de plus de 0,05 unité après l'ajout de la protéine ou de l'enzyme, la concentration du tampon peut d'abord être augmentée à 50 mM. Jusqu'à cette concentration, aucune interférence avec les "bons tampons" n'a été observée lors d'expériences de culture cellulaire. Pour former des complexes avec des métaux lourds, il est possible d'ajouter de l'EDTA.

Choix des substances tampons en fonction de l'application
Le choix d'un tampon ou non dépend également de la méthode pour laquelle il est utilisé. Outre la mesure de l'activité, la concentration en protéines est généralement déterminée après des processus d'isolement ou de purification. De nombreuses substances tampons à base d'acides aminés peuvent donner des résultats faussement positifs dans les dosages de protéines (par ex. Lowry) en raison d'interactions avec les réactifs ou de l'absorption de la substance tampon elle-même dans une plage supérieure à 230 nm. Ces interférences peuvent toutefois être facilement éliminées en intégrant le tampon dans le contrôle du blanc ou le contrôle négatif.

De nombreux tampons sont en principe adaptés à la filtration sur gel. Les tampons cationiques comme le Tris sont préférés pour la chromatographie d'échange d'anions. Les tampons anioniques (comme le phosphate ou le MES) sont préférables pour la chromatographie d'échange de cations ou la chromatographie d'hydroxyapatite, c'est-à-dire que le tampon doit avoir la même charge que le matériau échangeur d'ions afin d'éviter qu'il ne se lie lui-même à l'échangeur d'ions.
Le borate ne convient pas pour l'isolement des glycoprotéines ou des systèmes contenant des nucléotides, car il interagit avec le groupe cis-hydroxyle des sucres. Si l'électrophorèse est réalisée après la dissolution de la protéine dans des systèmes de purification des protéines, il convient d'utiliser un tampon de faible force ionique, car une force ionique élevée réchaufferait le gel.

Les "bons tampons" à base du cycle pipérazine - HEPES, HEPPS, HEPPSO et PIPES - ne sont pas adaptés à l'étude des processus d'oxydoréduction, car ils forment des radicaux d'oxygène en présence de H₂O₂, du fer auto-oxydant ou, dans certaines conditions électrolytiques, des radicaux faciles. En revanche, le "good buffer" à base d'un anneau de morpholine, le MES, ne forme pas de radicaux.

Remarques sur l'ajustement du pH d'un tampon
Les tampons sont composés d'un acide et de sa base conjuguée. La qualité d'un tampon dépend de sa capacité tampon, c'est-à-dire de sa résistance aux variations du pH lors de l'ajout d'acides ou de bases forts. En d'autres termes, le pouvoir tampon correspond à la quantité d'ions H⁺- ou OH^-- qui peuvent être neutralisés par le tampon. Le pouvoir tampon est lié à la concentration du tampon et atteint son maximum à la valeur pK_a. Ce point correspond donc au centre de la plage de pH couverte par le tampon. Ici, la concentration d'acide et de base est identique. Au voisinage de cette zone de pH, des quantités relativement importantes de H⁺-/OH^-- ne provoquent donc que de petits changements de pH. Un tampon dont la valeur de pH est supérieure ou inférieure d'une unité de pH à sa valeur pK_a ne présente plus de pouvoir tampon.

L'ajustement du pH n'est pas aussi simple qu'il n'y paraît à première vue. Il existe un certain nombre de facteurs qui influencent la concentration de protons et qui ont un impact sur le fonctionnement du tampon :

Acide/base : Le pH est généralement ajusté avec NaOH/KOH ou HCl. En ajoutant lentement l'acide ou la base sous forte agitation, on évite qu'une forte concentration d'ions H⁺ ou OH^- n'apparaisse localement. Dans le cas contraire, les substances tampons peuvent être modifiées chimiquement de manière à être inactivées ou à avoir un effet inhibiteur sous une forme modifiée. Si la forme protonée (acide) et la forme non protonée (base) d'un tampon sont disponibles, la valeur du pH peut également être ajustée en mélangeant les deux substances. Si des cations monovalents sont gênants ou doivent être étudiés, le pH peut être ajusté avec de l'hydroxyde de tétraméthyle ou de tétraéthylammonium. Au lieu de HCl, on peut utiliser de l'acétate, du sulfate ou du glutamate, bien qu'il existe dans ce cas un risque d'influence sur une enzyme.

Température : la valeur du pH d'un tampon peut varier en fonction de la substance du tampon et de la température. Il est donc recommandé de régler le pH à la température à laquelle on travaillera plus tard. Dans la plupart des cellules animales, le pH physiologique à 37 °C se situe dans la plage de pH 7,0 - 7,5. Le tris est un tampon particulièrement sensible à la température. Réglé à 7,5 à 37 °C, il augmente en fonction de la température dans le système de test à 0 °C jusqu'à environ 8,5. Les tampons de Good sont généralement peu sensibles à la température, les tampons d'acide carboxylique (citrate, format, succinate) encore moins.

Additifs pour tampons : Si d'autres composants sont ajoutés au tampon (par ex. EDTA, DTT, Mg²⁺), il faut s'attendre à des modifications de la valeur du pH et il convient de la mesurer à nouveau.

Force ionique : comme pour le réglage du pH, il convient de procéder au choix de l'électrolyte pour régler la force ionique de la solution tampon (si nécessaire), car elle augmente en fonction de l'électrolyte utilisé. Les sels de tétraméthyl- ou de tétraéthylammonium sont appropriés pour ajuster la force ionique, car les grands cations interagissent moins bien avec les charges négatives des enzymes. L'acétate, en tant que grand anion, interagit pour sa part mal avec les métaux alcalins.

Contrôle par pH-mètre : lors du réglage du pH d'un tampon, on dispose aujourd'hui en général de pH-mètres précis à affichage numérique. Le pH-mètre est étalonné à l'aide de deux étalons de pH qui englobent la plage du tampon à régler. En cas de doute sur la précision de la mesure, il suffit d'étalonner le pH-mètre avec un tampon phosphate de 50 mm, puis de le diluer 10 fois. La valeur du pH devrait alors être supérieure de 0,2 unité de pH.
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