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Détermination de l'azote suivant la méthode Kjeldahl

La méthode Kjeldahl ou la minéralisation Kjeldahl détermine la teneur en azote des échantillons organiques et inorganiques.

Depuis plus de 100 ans, la méthode Kjeldahl est utilisée pour la détermination de l'azote dans une large gamme d'échantillons. La détermination de l'azote Kjeldahl est effectuée dans les aliments, les boissons, la viande, les céréales, le petfood et les fourrages pour le calcul de la teneur en protéines. La méthode de minéralisation Kjeldahl est également utilisée pour la détermination de l'azote dans les eaux usées, les sols et autres échantillons.

Il s'agit d'une méthode officielle, décrite dans différentes normes telles que l'AOAC, l'EPA, l'ISO, le DIN, les pharmacopées et différentes directives européennes.

Voici quelques exemples de ces procédures officielles :

● Analyse du lait : Détermination de la teneur en azote : EN ISO 8968, AOAC 991.20, Azote total du lait ; AOAC 991.22 et 991.23, Teneur en azote protéique du lait ; Règlement (CE) n° 273/2008 de la Commission européenne, Méthodes d'analyse et d'évaluation de la qualité du lait et des produits laitiers.
● Analyse de l'eau : Méthode EPA 351.2, Détermination de l'azote total de Kjeldahl dans l'eau.
● Analyse des aliments pour animaux : Règlement (CE) n° 152/2009 de la Commission européenne, Méthodes d'échantillonnage et d'analyse pour le contrôle officiel des aliments pour animaux - Détermination de la teneur en protéines brutes.
● Analyse des produits pharmaceutiques : Pharmacopée européenne (Ph. Eur.) méthode 2.5.9., Pharmacopée des États-Unis (USP), méthode <461>. Détermination de l'azote.

La procédure Kjeldahl comporte trois grandes étapes :

i) Minéralisation - l'azote organique est transformé en NH₄⁺.
ii) Distillation - Le NH₄⁺ est distillé et retenu.
iii) Titrage - La teneur en azote est déterminée.

Minéralisation
L’objectif de la minéralisation est de casser toutes les liaisons d'azote dans l'échantillon et de convertir tout l'azote organique en ions ammonium (NH₄⁺). Le carbone organique digéré par l'acide sulfurique forme du dioxyde de carbone et de l'eau. Dans ce processus, la matière organique se carbonise, ce qui peut être visualisé par la transformation de l'échantillon en mousse noire. Pendant la minéralisation, la mousse se décompose et finalement un liquide clair indique l'achèvement de la réaction chimique. Pour cela, l'échantillon est mélangé à de l'acide sulfurique à des températures comprises entre 350 et 380 °C. Plus la température utilisée est élevée, plus la minéralisation est rapide. La vitesse de la minéralisation est accélérée par l'ajout de sels et de catalyseurs. Du sulfate de sodium et/ou de potassium est ajouté pour augmenter le point d'ébullition de l'acide sulfurique et des catalyseurs sont ajoutés pour augmenter la vitesse et l'efficacité de la procédure de minéralisation. Des agents oxydants comme le peroxyde d'hydrogène (eau oxygénée) peuvent également être ajoutés pour augmenter la vitesse.

Le temps de minéralisation dépend de la structure chimique de l'échantillon, de la température, des quantités de sel de sulfate et du catalyseur :

CHNO + H₂SO₄ à (NH₄⁺)₂SO₄ + H₂O

Commentaires : réaction catalytique ; composés organiques : protéines, acides aminés, peptides, amines, amides, ...
Une fois la minéralisation terminée, l'échantillon est laissé à refroidir à température ambiante, puis dilué avec de l'eau et transféré dans l'unité de distillation.

Dans les applications générales de l'alimentation humaine et animale, l'acide sulfurique à 98% est utilisé pour les minéralisations. Des agents oxydants peuvent également être ajoutés pour améliorer encore la vitesse. Le peroxyde d'hydrogène est le plus utilisé, car il accélère la décomposition de la matière organique et a une action antimousse pour contrôler la formation de mousse pendant la minéralisation, particulièrement efficace lorsque l'échantillon contient des graisses ou des hydrates de carbone. Cependant, l'utilisation de peroxyde d'hydrogène, qui est très réactif en présence d'acide sulfurique, peut entraîner la perte d'azote sous forme de gaz N₂. Par conséquent, le peroxyde d'hydrogène n'est recommandé que lorsqu'il y a un gain de durée de minéralisation, et il doit être ajouté à l'échantillon progressivement. Si la formation de mousse est le seul problème, il est préférable d'utiliser 1 à 3 gouttes d'une émulsion anti-mousse brevetée. Après la minéralisation et avant la neutralisation de l'acide sulfurique par l'ajout d'hydroxyde de sodium concentré, on laisse l'échantillon refroidir à température ambiante et on le dilue avec de l'eau distillée. Ceci est fait pour éviter les éclaboussures de l'échantillon lors de la réaction exothermiqe de mélange de l'acide et de la base concentrés. De plus, si les échantillons sont dilués avec 10-20 ml d'eau juste après le refroidissement, la cristallisation peut être évitée.

Préparation de l'échantillon
Préparation de l'échantillon : l'échantillon doit être homogène et le poids de l'échantillon adapté à la teneur en azote prévisionnelle. Pendant la minéralisation, les substances organiques sont détruites par l'acide sulfurique. Les catalyseurs Kjeldahl en comprimés augmentent le point d'ébullition du mélange et rendent le processus plus rapide. La prise d'échantillon dépend de :

● La teneur en azote : pour une teneur en N plus élevée, un prise d’échantillon réduite.
● L'homogénéité de l'échantillon : si l'échantillon n'est pas homogène, vous pouvez en réduire l'impact en augmentant le poids. Moins de 1 g pour un échantillon homogène. Un poids plus important > 2 g pour les échantillons non homogènes.
● La concentration du réactif de titrage : la consommation de réactif de titrage doit être approximativement comprise entre 5 et 15 mL.

Ensuite, des produits chimiques doivent être ajoutés à l'échantillon : de l'acide sulfurique et des catalyseurs.

La quantité d'acide sulfurique à utiliser est donnée par :

● Conversion en K₂SO₄ (le K₂SO₄ est un composant des catalyseurs).
● Consommation d'acide sulfurique par la matière organique.
● Pertes dues à l'évaporation pendant l'ébullition (1 mL par heure d'ébullition).
● Volume restant compte tenu du volume des tablettes de catalyseurs et de l'acide sulfurique utilisé.

Les catalyseurs sont utilisés pour accélérer la réaction en augmentant le point d'ébullition du mélange et agissent avec un effet de catalyse métallique.

Catalyseurs Kjeldahl
Les catalyseurs Kjeldahl sont généralement des comprimés ou des poudres composés à plus de 97% d'un sel qui augmente la température d'ébullition de l'acide sulfurique et de 1 à 3% d'un type de catalyseur ou d'un mélange de catalyseurs pour augmenter la vitesse et l'efficacité de la procédure de minéralisation. Les catalyseurs typiques sont le sélénium ou les sels métalliques de cuivre ou de titane. Le choix d'un catalyseur dépend d'aspects environnementaux ou de raisons plus pratiques comme le temps de réaction ou l’apparition de mousse. Par exemple, le catalyseur de Wieninger contenant du sélénium réagit plus rapidement mais est plus toxique au niveau environnemental qu'un catalyseur contenant du cuivre comme le Missouri. Le catalyseur dit Missouri est plus sûr pour l'homme et l'environnement mais donne un processus de minéralisation plus lent. Un compromis est l’usage d’un catalyseur mixte composé de sulfate de cuivre et de titane.

Le choix du catalyseur est multifactoriel comme:

● Temps nécessaire à la minéralisation.
● Normes en usage.
● Impacts sécurité et environmental
● Formation de mousse avec de type d’échantillon.

Le protocole classique pour les échantillons sans contrainte particulière est un point d'ébullition de 370 ºC, en utilisant 20 mL d'acide sulfurique 98% et 5 g de catalyseurs.

Conseils pour la minéralisation
● Les conditions optimales sont atteintes lorsque la zone de condensation reste à 5 cm en dessous de l'étranglement du tube d'échantillon.
● Pour les échantillons moussants, on peut utiliser de l'"Antifoam" ou de l'acide stéarique.
● Pour réduire le temps de minéralisation, ajouter du H₂O₂ est une solution.
● Utilisation minimale de produits chimiques en utilisant des micro-Kjeldahl lorsque cela est possible.
● L'augmentation lente de la température de minéralisation réduit la formation de mousse dans les échantillons difficiles.

Aperçu de la minéraliation

Distillation
D'une manière générale, l'échantillon acide est dilué avec de l'eau et neutralisé au moyen d'une solution concentrée d'hydroxyde de sodium. Pendant l'étape de distillation, les ions ammonium (NH₄⁺) sont transformés en ammoniac (NH₃) par l'ajout d'un alcali (NaOH). L'ammoniac (NH₃) est transféré dans un collecteur suite à la distillation à la vapeur. Le collecteur du distillat est rempli d'une solution absorbante pour capturer le gaz ammoniac dissous. Les solutions absorbantes courantes comprennent de l'acide borique [B(OH)₃] aqueux à une concentration de 2 à 4 %. D'autres acides, dosés avec précision, comme l'acide sulfurique ou l'acide chlorhydrique, peuvent également être utilisés pour capturer l'ammoniac, sous forme d'ions ammonium solvatés.

(NH₄)₂SO₄ + 2 NaOH à 2 NH₃ (gas) + Na₂SO₄ + 2 H₂O

Procédure
● Dilution du mélange de minéralisation acide par ajout d'eau
● Alcalinisation pour convertir le NH₄⁺ en NH₃ par addition d'hydroxyde de sodium.
● Distillation par entraînement à la vapeur d'eau pour extraire le NH₃ .
● Collecte de l'ammoniac dans une solution réceptrice acide. Cette étape peut varier car elle conduit à un titrage direct de l'acide borique ou à un titrage inverse

○ Étapes dans le cas d'un titrage d'acide borique:

- Dilution avec de l'eau, généralement 4 ml par ml d'acide sulfurique utilisé, 2,5 ml lorsqu'un échantillonneur automatique est utilisé. Cela permet d'éviter les réactions violentes
- Alcalinisation avec de l'hydroxyde de sodium 32%. 4,5 mL par mL utilisé d'acide sulfurique, convertissant NH₄⁺ en NH₃.
- Préparation du récepteur : utiliser de l'acide borique à 2% avec du KCl pour une faible teneur en N, 0,02 -6,75 mg/tube échantillon. Utiliser de l'acide borique à 4%.

○ Etapes en cas de titrage à rebours :

- Dilution avec de l'eau, typiquement 4 ml par ml d'acide sulfurique utilisé, 2,5 ml dans le cas où un passeur automatique d'échantillons est connecté. Ceci permet d'éviter les réactions violentes.
- Alcalinisation avec de l'hydroxyde de sodium 32%, 4,5 mL par mL d'acide sulfurique utilisé, convertissant NH₄⁺ en NH₃.
- Préparation du récepteur : utiliser de l'acide sulfurique 0,25 ml/L. Le volume doit être dosé précisément et sera généralement de 20 mL.
- Distillation à la vapeur d'eau entre 180-300 s pour séparer le NH₃
- Recueillir l'échantillon dans l'acide sulfurique avec de l'ammoniac. Le tuyau de sortie du condensateur et l'électrode doivent être complètement immergés.

Conseils pour la distillation
● Après la minéralisation, les échantillons doivent être refroidis à une température de 50 à 100 °C avant de pouvoir être traités plus avant.
● La concentration optimale d'hydroxyde de sodium est de 32%.
● Pour les très faibles teneurs en N, il faut choisir comme solution réceptrice de l'acide borique à 2% avec du chlorure de potassium (3 g/L) pour obtenir des limites de détection plus basses.

Aperçu de la distillation

Titration
La concentration des ions ammonium capturés peut être déterminée à l'aide de deux types de titrages :

1. Lorsqu'on utilise la solution d'acide borique comme solution absorbante, on effectue un titrage acide-base en utilisant des solutions standard d'acide sulfurique ou d'acide chlorhydrique et un mélange d'indicateurs. En fonction de la quantité d'ions ammonium présents, des concentrations comprises entre 0,01 mol/L et 0,5 mol/L sont utilisées. La détection du point final peut être effectuée manuellement, avec un titrage colorimétrique, en utilisant une combinaison d'indicateurs. La combinaison des indicateurs rouge de méthyle et bleu de méthylène est fréquemment utilisée. On peut aussi déterminer le point final par potentiométrie avec une électrode de pH. Ce type de titrage est appelé titrage direct :

B(OH)₄^- + HX ↔ X^- + B(OH)₃ + H₂O
HX= strong acid (X=Cl^-, etc.)

2. En utilisant une solution standard d'acide sulfurique comme solution absorbante, l'acide sulfurique résiduel (l'excès n'ayant pas réagi avec le NH₃) est titré avec une solution standard d'hydroxyde de sodium et, par différence, la quantité d'ammoniac est calculée. Le point final est détecté à l'aide d'un indicateur coloré. Le rouge de méthyle est généralement l'indicateur préféré. Ce titrage est appelé titrage à rebours:

H₂SO₄ (Résiduel) + 2NaOH --> SO₄^2- + 2Na⁺ + 2H₂O

Conseils pour le titrage
● Selon la réglementation ou la méthode, on peut choisir un titrage potentiométrique ou colorimétrique.
● Pour le point final et le titrage colorimétrique, le pH de l'acide borique doit être ajusté à 4,65.
● Le titrage à rebours peut être utilisé lorsque l'acide borique doit être évité (pour le titrage potentiométrique uniquement).
● Pour les échantillons bien connus, un volume de départ pour le titrage peut être utilisé pour accélérer l'étape de titrage. (Seulement utile pour les volumes de titration élevés)
● Le processus de distillation et de titration peut être synchronisé, grâce à la titration en ligne.

Aperçu de la phase de titration

Calculs
Les calculs du % d'azote ou du % de protéines tiennent compte du type de solution réceptrice utilisée et des éventuels facteurs de dilution utilisés pendant le processus de distillation. Dans les équations ci-dessous, "N" représente la normalité. " mL de blanc " désigne les millilitres de base nécessaires pour titrer à rebours un blanc de réactif si l'acide standard est la solution réceptrice ou désigne les millilitres d'acide standard nécessaires pour titrer un blanc de réactif si l'acide borique est la solution réceptrice.

● Lorsque l'acide borique est utilisé comme solution réceptrice, l'équation est la suivante :

% d'azote = (mL d'acide standard - mL de blanc) x N de l'acide x 1,4007 / Poids de l'échantillon (g)

● Si l’acide chlorhydrique/sulfurique titré est utilisé comme collecteur de l’ammoniumis, l’équation est la suivante :
% d'azote = ((mL d'acide standard x N d'acide) - (mL de blanc x N de base)) - (mL de base standard x N de base) x 1,4007 / Poids de l'échantillon (g)

Si l'on souhaite déterminer le % de protéines au lieu du % d'azote, le % de N calculé est multiplié par un facteur qui dépend du type de protéines présentes dans l'échantillon. On peut trouver quelques exemples dans le tableau suivant* :

* Source : Adapté et modifié de Merrill et Watt (1973)

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